लंबे समय तक माउस ब्रेन इमेजिंग के लिए एक पॉलिश और प्रबलित विंडो पतला - खोपड़ी

Summary

हम एक लिए माउस खोपड़ी है कि मिलीमीटर तक फैला है और मस्तिष्क की सूजन के बिना महीने के लिए स्थिर है में एक इमेजिंग विंडो के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि को अच्छी तरह से दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए रक्त प्रवाह, सेलुलर गतिशीलता, और सेल / संवहनी संरचना की अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुकूल है.

Abstract

के cortical समारोह के vivo में इमेजिंग intracranial पर्यावरण के विघटन के बिना मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की आवश्यकता है. हम एक माउस खोपड़ी है कि व्यास में कई मिलीमीटर तक फैला है और महीने के लिए स्थिर है में एक पॉलिश और प्रबलित पतला खोपड़ी (बंदरगाहों) खिड़की के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. खोपड़ी मोटाई में 10 से 15 माइक्रोन के लिए एक हाथ ड्रिल आयोजित करने के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता प्राप्त करने के साथ पतला है, और है तो cyanoacrylate गोंद और एक कवर ग्लास से मढ़ा: 1), 2 कठोरता प्रदान करने के लिए) हड्डी regrowth को रोकना और 3) प्रकाश बिखरने को कम हड्डी की सतह पर अनियमितताओं से. के बाद से खोपड़ी का उल्लंघन नहीं है, किसी भी सूजन है कि अध्ययन किया जा रहा है की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है बहुत कम है. इमेजिंग cortical सतह के नीचे 250 माइक्रोन तक की गहराई दो photon माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस विंडो को अच्छी तरह से दोनों संवेदनाहृत और जाग तैयारी में मस्तिष्क रक्त प्रवाह और सेलुलर समारोह का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. यह आगे सेशन प्रदान करता हैportunity सेल गतिविधि का उपयोग optogenetics हेरफेर करने के लिए या photosensitizers परिसंचारी के विकिरण द्वारा लक्षित वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह को बाधित.

Protocol

1. ^मैं सर्जरी के लिए तैयारी

1. एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर के में Maxizyme और सर्जिकल दूध का एक मिश्रण में sonicating द्वारा सर्जिकल उपकरण साफ करें. प्रत्येक प्रयोग से पहले शल्य चिकित्सा उपकरण आटोक्लेव.
2. सुनिश्.......

Discussion

दो photon इमेजिंग एक बंदरगाहों खिड़की के माध्यम से पतला हड्डी और ड्यूरा, जो लेज़र प्रकाश attenuates और अधिक से अधिक ⁸ गहराई में ऑप्टिकल aberrations कहते हैं के माध्यम से प्रसारण की आवश्यकता है. हालांकि, इस खामी के बावज.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
एजेंट	प्रसव के मार्ग	माउस के लिए खुराक	अवधि	नोट्स	स्रोत	रेफरी रेफरी
Pentobarbital (Nembutal)	आईपी	90 / μg जी	15-60 मिनट	संकीर्ण सुरक्षा मार्जिन. संज्ञाहरण की उचित खुराक के लिए धीरे से काम. प्रेरण खुराक के 10% के अनुपूरक के रूप में आवश्यक है.	036,093, बटलर Schein	7
Ketamine (Ketaset) Xylazine (Anased) के साथ मिश्रित	आईपी	60 / μg जी (कश्मीर) 10 μg / g (एक्स) (एक ही सिरिंज में मिश्रण)	20-30 मिनट	Xylazine है मांसपेशियों को आराम और एनाल्जेसिक के रूप में सह इंजेक्शन. प्रेरण खुराक के 50% पर Ketamine केवल अनुपूरक के रूप में आवश्यक है.	010,177 (कश्मीर), 033,198 (एक्स), बटलर Schein	7
Isoflurane (Isothesia)	साँस लेना	4% वायुकोशीय एकाग्रता शामिल करने के लिए (मैक) का मतलब है, 1-2% के रखरखाव के लिए मैक	4-6 घंटे.	70% और 30% ऑक्सीजन नाइट्रस ऑक्साइड के मिश्रण में प्रदान की है. लंबे समय तक संज्ञाहरण वसूली धीमी गति से होता है.	029,403, बटलर Schein	26

आइटम	कंपनी	सूची # / मॉडल
Betadine	बटलर Schein	6906950
Buprenorphine (Buprenex)	बटलर Schein	+०३१९१९
Fluorescein आइसोथियोसाइनेट, dextran, 2 एमडीए आणविक भार	सिग्मा	FD2000S
Isopropyl शराब	मछुआ	AC42383 - 0,010
Lactated है घंटी समाधान	बटलर Schein	009,846;
Lidocaine समाधान, 2% (v / v)	बटलर Schein	002,468
खारा	बटलर Schein	009,861
सर्जिकल दूध	बटलर Schein
टेक्सास लाल dextran 70 केडीए आणविक वजन	Invitrogen	D1864
Maxizyme	बटलर Schein	035,646
DISPOSABLES
कार्बाइड burrs, 1/2 मिमी टिप आकार	ठीक विज्ञान उपकरण	19007-05
Cottoned टिप applicators	फिशर साइंटिफिक	23-400-100
कवर ग्लास, नहीं. 0 मोटाई	थॉमस वैज्ञानिक	6661B40
Cyanoacrylate गोंद	एन डी इंडस्ट्रीज	31,428 H04308
गैस झाड़न	Newegg	N82E16848043429
पकड़ सीमेंट पाउडर	Dentsply	675,571
पकड़ सीमेंट विलायक	Dentsply	६७५५७२
इंसुलिन सिरिंज, 0.3 29.5 गेज सुई के साथ एमएल मात्रा	बटलर Schein	018,384
नट और बोल्ट के लिए सिर सुरक्षित	Digikey	अखरोट, H723 - एन डी, बोल्ट, R2-56X1/4-ND
ऑप्थाल्मिक मरहम	बटलर Schein	०,३९,८८६
स्केलपेल ब्लेड	फिशर साइंटिफिक	12-460-448
शिकंजा, आत्म दोहन # 000	जी मॉरिस कंपनी	FF000CE125
सिलिकॉन मछलीघर सीलेंट	Perfecto विनिर्माण	31,001
टिन ऑक्साइड पाउडर	माँ खनिज	Eqt - TINOX
उपकरणों
ग्लास मुंशी	फिशर साइंटिफिक	08-675
खुर्दबीन विदारक	कार्ल Zeiss	OPMI - एक एफसी
बिजली चालित ड्रिल	Foredom या Osada	K.1020 (Foredom) या EXL-M40 (Osada)
बिजली उस्तरा	Wahl	8900 श्रृंखला
संदंश, Dumont नहीं. 55	ठीक विज्ञान उपकरण	11255-20
प्रतिक्रिया विनियमित गर्मी पैड	FHC	40-90-8 (गुदा thermistor, 40-90-5D-02, जपैड, 40-90-2-07 खाने)
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	IsoTec4
पल्स oximeter	स्टार लाइफ साइंसेज	MouseOx
पेचकश, लघु	अटारी उतारा	26B09.01
Stereotaxic फ्रेम	KOPF उपकरण	900 मॉडल (माउस संज्ञाहरण मुखौटा और गैर टूटना कान सलाखों के साथ)
सर्जिकल कैंची, कुंद अंत	ठीक विज्ञान उपकरण	14078-10
अल्ट्रासोनिक क्लीनर	फिशर साइंटिफिक	15-335-30