En polert og forsterket tynnet-skalle Window for langsiktig Imaging av Mouse Brain

Summary

Vi presenterer en metode for å danne en avbildning vindu i musen hodeskallen som spenner millimeter og er stabil i flere måneder uten betennelse i hjernen. Denne metoden egner seg godt for longitudinelle studier av blodstrøm, cellulære dynamikk, og celle / vaskulær struktur ved hjelp av to-foton mikroskopi.

Abstract

In vivo avbildning av kortikal funksjon krever optisk tilgang til hjernen uten avbrudd av intrakraniell miljøet. Vi presenterer en metode for å danne en polert og forsterket tynnet hodeskallen (porter) vindu i musen hodeskallen som spenner over flere millimeter i diameter og er stabil i flere måneder. Skallen er tynnet 10 til 15 mikrometer i tykkelse med en håndholdt drill for å oppnå optisk klarhet, og deretter kledde med Cyanoakrylat lim og et dekke glass til: 1) gir stivhet, 2) hemmer bein gjenvekst og 3) redusere lysspredning fra uregelmessigheter på beinet overflaten. Siden skallen ikke er brutt, er enhver betennelse som kan påvirke prosessen som studeres sterkt redusert. Imaging dybder opp til 250 mikrometer under kortikale overflate kan oppnås ved å bruke to-foton laser scanning mikroskopi. Dette vinduet er godt egnet til å studere cerebral blodstrøm og cellulær funksjon i både anesteserte og våken forberedelser. Det gir ytterligere opportunity å manipulere celleaktivitet bruke optogenetics eller å forstyrre blodgjennomstrømningen i målrettede skip ved bestråling av sirkulerende fotosensitisere.

Protocol

1. Forberedelse til kirurgi ⁱ

1. Rengjør de kirurgiske verktøy ved sonicating i en blanding av Maxizyme og kirurgisk Milk i en ultrasoniske renere. Autoklaver kirurgiske verktøy før hvert forsøk.
2. Sikre at alle nødvendige reagenser og forbruksmateriell er tilgjengelig. En liste av reagenser og forbruksmateriell er gitt i Tabell 2. Reagenser og forbruksmateriell som kommer i kontakt med utsatt vev bør være steril, når det er mulig.
3. Indusere anestesi. Typiske bedøvelse egnet.......

Discussion

To-foton bildebehandling gjennom en PORTS vindu krever overføring gjennom tynnet bein og dura, som demper laserlys og legger optiske avvik på større dyp ^8. Men til tross for denne ulempen, kan bildebehandling dybder opp til 250 mikrometer under pial overflaten oppnås med 900 nm eksitasjon. Større bildebehandling dybder kan i prinsippet være mulig med lengre eksitasjonsbølgelengdene ^13. En stor fordel med denne metoden er fraværet av kortikale betennelse som kan eksistere forbigående i meto.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agent	Route av levering	Dose for mus	Varighet	Merknader	Kilde	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 mikrogram / g	15-60 min	Smal sikkerhetsmargin. Arbeid opp til riktig dose av anestesi sakte. Tillegg 10% av induksjon dose som kreves.	036093; Butler Schein	7
Ketamin (Ketaset) blandet med xylazin (Anased)	IP	60 mikrogram / g (K) 10 mikrogram / g (X) (bland i samme sprøyte)	20-30 min	Xylazin er co-injiseres som et muskelavslappende middel og smertestillende. Supplement bare Ketamin på 50% av induksjon dose som kreves.	(K) 010 177, (X) 033198; Butler Schein	7
Isofluran (Isothesia)	Innånding	4% mener alveolar konsentrasjon (MAC) for induksjon; 1-2% MAC for vedlikehold	4-6 timer.	Forutsatt i blanding av 70% oksygen og 30% lystgass. Langvarig anestesi fører til langsom bedring.	029403; Butler Schein	26

SAK	COMPANY	CATALOG # / MODELL
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorfin (Buprenex)	Butler Schein	031919
Fluorescein isothiocyanate dekstran, 2 MDA molekylvekt	Sigma	FD2000S
Isopropylalkohol	Fisher	AC42383-0010
Ringer-laktat oppløsning	Butler Schein	009846;
Lidokain løsning, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Saline	Butler Schein	009861
Kirurgisk Milk	Butler Schein	014 325
Texas Red dekstran, 70 kDa molekylvekt	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
Forbruksmateriell
Carbide grader, 1/2 mm dysestørrelse	Fin Science Verktøy	19007-05
Cottoned spissen applikatorer	Fisher Scientific	23-400-100
Dekk Glass, nei. 0 tykkelse	Thomas Scientific	6661B40
Cyanoakrylat lim	ND Industries	31428 H04308
Gass Duster	Newegg	N82E16848043429
Grip sementpulver	DENTSPLY	675571
Grip sement løsemiddel	DENTSPLY	675572
Insulin sprøyte, 0,3 ml volum med 29,5 gauge nål	Butler Schein	018384
Mutter og bolt for å feste hodet	Digikey	Mutter, H723-ND, bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic salve	Butler Schein	039886
Skalpell blad	Fisher Scientific	12-460-448
Skruer, selvborende # 000	JI Morris Firma	FF000CE125
Silikon akvarium tetningsmasse	Perfecto Manufacturing	31001
Tinn oksid pulver	Mammas Minerals	EQT-TINOX
UTSTYR
Glass skriftlærd	Fisher Scientific	08-675
Dissekere mikroskop	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Elektrisk drevet drill	Foredom eller Osada	K.1020 (Foredom) eller EXL-M40 (Osada)
Elektrisk barbermaskin	Wahl	Series 8900
Tang, Dumont nei. 55	Fin Science Verktøy	11255-20
Tilbakemelding regulerte varmen pad	FHC	40-90-8 (rektal termistor, 40-90-5D-02; hspiser pad, 40-90-2-07)
Isofluran vaporizer	Ohmeda	IsoTec4
Pulsoksimeter	Starr og biovitenskap	MouseOx
Skrutrekker, miniatyr	Garret Wade	26B09.01
Stereotaxic ramme	Kopf Instrumenter	Modell 900 (med mus anestesi maske og ikke-ruptur øret barer)
Kirurgiske sakser, butte enden	Fin Science Verktøy	14078-10
Ultrasoniske renere	Fisher Scientific	15-335-30