Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Summary

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Abstract

En vivo de imágenes de la función cortical requiere acceso óptico hasta el cerebro, sin alteración del medio ambiente intracraneal. Se presenta un método para formar un cráneo pulido y reforzado con adelgazado (puertos) ventana en el cráneo del ratón que se extiende por varios milímetros de diámetro y se mantiene estable desde hace meses. El cráneo está adelgazada para 10 a 15 micras de espesor con un taladro de mano para lograr la claridad óptica, y después se cubrió con pegamento de cianoacrilato y una cubierta de vidrio para: 1) proporcionar rigidez, 2) inhibir la regeneración ósea y 3) reducir la dispersión de luz a partir de las irregularidades sobre la superficie del hueso. Dado que el cráneo no se rompe, la inflamación que puede afectar al proceso objeto de estudio se reduce considerablemente. Profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie cortical se puede lograr utilizando dos fotones de microscopía de barrido láser. Esta ventana se adapta bien para estudiar el flujo sanguíneo cerebral y la función celular en forma de preparados tanto anestesiados y despierto. Además, ofrece la optunidad para manipular la actividad de células utilizando optogenética o para interrumpir el flujo de sangre en los vasos dirigidos por irradiación de circulante fotosensibilizadores.

Protocol

1. Preparativos para la operación ⁱ

1. Limpiar los instrumentos quirúrgicos por tratamiento con ultrasonidos en una mezcla de leche Maxizyme y Quirúrgicas en un limpiador ultrasónico. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos antes de cada experimento.
2. Asegúrese de que todos los reactivos necesarios y desechables están disponibles. Una lista de los reactivos y desechables se proporciona en la Tabla 2. Los reactivos y material desechable que entran en contacto con los tejidos expuestos.......

Discussion

De dos fotones de imágenes a través de una ventana de los puertos exige la transmisión a través del hueso adelgazado y la duramadre, que atenúa la luz del láser, y añade las aberraciones ópticas a mayores profundidades ^8. Sin embargo, a pesar de este inconveniente, las profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial se puede lograr con 900 nm de excitación. Mayores profundidades de imagen puede ser en principio posible con longitudes de onda de excitación más largos

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agente	Ruta de la entrega	Dosis para el ratón	Duración	Notas	Fuente	Ref. Ref.
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Estrecho margen de seguridad. Trabajar hasta una dosis adecuada de anestesia lentamente. Suplemento 10% de la dosis de inducción según sea necesario.	036093; mayordomo Schein	7
La ketamina (Ketaset) mezclado con xilazina (Anased)	IP	60 mg / g (K) 10 mg / g (X) (mezcla en la misma jeringa)	20-30 min	Xilazina es co-inyectado como un relajante muscular y analgésico. Suplemento sólo ketamina a 50% de la dosis de inducción según sea necesario.	(K) 010 177, (X) 033 198; Butler, Schein	7
El isoflurano (Isothesia)	Inhalación	4% de media de la concentración alveolar (MAC) para la inducción; 1.2% MAC para el mantenimiento	4-6 h.	Siempre en mezcla de 70% de oxígeno y 30% de óxido nitroso. La anestesia prolongada conduce a la lenta recuperación.	029403; mayordomo Schein	26

TEMA	EMPRESA	Catálogo # / MODELO
Betadine	Butler, Schein	6906950
La buprenorfina (Buprenex)	Butler, Schein	031919
Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 de peso molecular MDa	Sigma	FD2000S
El alcohol isopropílico	Pescador	AC42383-0010
Solución de Ringer Lactato	Butler, Schein	009846;
La lidocaína solución, 2% (v / v)	Butler, Schein	002468
Salina	Butler, Schein	009861
Leche quirúrgica	Butler, Schein	014325
Rojo Texas dextrano, 70 kDa de peso molecular	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler, Schein	035646
DESECHABLES
Carburo de rebabas, tamaño de la punta 2.1 mm	Herramientas de Bellas Ciencia	19007-05
Aplicadores cottoned punta	Fisher Scientific	23-400-100
Cubierta de vidrio, no. 0 espesor	Thomas Scientific	6661B40
Pegamento de cianoacrilato	ND Industrias	31428 H04308
Gas plumero	Newegg	N82E16848043429
Grip polvo de cemento	Dentsply	675571
Grip cemento solvente	Dentsply	675572
Jeringa de insulina, 0,3 ml de volumen, con aguja de calibre 29,5	Butler, Schein	018384
Tuerca y tornillo para asegurar la cabeza	Digikey	Nut, H723-ND, perno, R2-56X1/4-ND
Pomada oftálmica	Butler, Schein	039886
Las hojas de bisturí	Fisher Scientific	12-460-448
Tornillos, autorroscante # 000	JI Morris Empresa	FF000CE125
De silicona de acuario sellador	Perfecto Manufactura	31001
Polvo de óxido de estaño	Minerales de mamá	EQT-TINOX
EQUIPO
Vidrio escribano	Fisher Scientific	08-675
Microscopio de disección	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Taladro eléctrico alimentado	Foredom o Osada	K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada)
Maquinilla de afeitar eléctrica	Wahl	Serie 8900
Pinzas, Dumont no. 55	Herramientas de Bellas Ciencia	11255-20
Comentarios almohadilla de calor regulado	FHC	40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer almohadilla, 40-90-2-07)
Vaporizador de isoflurano	Ohmeda	IsoTec4
Oxímetro de pulso	Starr Ciencias de la Vida	MouseOx
Destornillador en miniatura	Garret Wade	26B09.01
Marco estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 900 (con la máscara del ratón anestesia y no ruptura de las barras de las orejas)
Tijeras quirúrgicas, extremo romo	Herramientas de Bellas Ciencia	14078-10
Limpiador ultrasónico	Fisher Scientific	15-335-30