Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Vi presenterar en metod för att bilda en avbildning fönster i mus skalle som sträcker sig över millimeter och är stabil under månader utan inflammation av hjärnan. Denna metod lämpar sig väl för longitudinella studier av blodflödet, cellulära dynamik, och cell / vaskulär struktur genom att använda två-foton-mikroskopi.

Abstract

Avbildning in vivo av kortikalt funktion kräver optisk tillgång till hjärnan utan störning av den intrakraniala miljön. Vi presenterar en metod för att bilda en polerad och förstärkt förtunnad skallen (portar) fönster i musen skallen som spänner över flera millimeter i diameter och är stabil i månader. Skallen förtunnas till 10 till 15 pm i tjocklek med en handburen borrmaskin för att uppnå optisk klarhet, och därefter täcktes med cyanoakrylatlim och ett täckglas för att: 1) ger styvhet, 2) inhibera benåterväxt och 3) reducera ljusspridning av oegentligheter på benet ytan. Eftersom skallen inte överskrids, är någon inflammation som kan påverka processen som studeras kraftigt. Bildgivande djup på upp till 250 pm under den kortikala ytan kan åstadkommas med användning av två-foton-mikroskopi laserskanning. Detta fönster är väl lämpad för att studera cerebralt blodflöde och cellulär funktion i både sövda och vakna beredningar. Det erbjuder ytterligare ophet att manipulera cellaktivitet med användning optogenetics eller att störa blodflödet i målinriktade kärl genom bestrålning av cirkulerande fotosensibilisatorer.

Protocol

1. Förberedelser för Kirurgi i

  1. Rengör de kirurgiska verktyg genom ultraljudsbehandling i en blandning av Maxizyme och kirurgiska mjölk i ett ultraljud renare. Autoklavera kirurgiska verktyg innan varje experiment.
  2. Se till att alla nödvändiga reagenser och förbrukningsvaror finns tillgängliga. En lista av reagens och engångsmaterial tillhandahålls i tabell 2. Reagens och engångsmaterial som kommer i kontakt med exponerad vävnad bör vara steril, om möjligt.
  3. Inducera .......

Discussion

Två-foton-avbildning genom en PORTS fönster kräver transmission genom den förtunnade benet och dura, som dämpar det laserljus och adderar optiska aberrationer på större djup 8. Trots denna nackdel, kan avbildning djup upp till 250 pm under pial ytan uppnås med 900 nm excitering. Större imaging djup kan i princip vara möjligt med längre exciteringsvåglängder 13. En stor fördel med denna metod är avsaknaden av kortikala inflammation som kan finnas övergående i metoder innebär full k.......

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av American Heart Association (Post-doc stipendium för att ays) och National Institutes of Health (MH085499, EB003832 och OD006831 till DK). Vi tackar Beth Friedman och Pablo Blinder för kommentarer på manuskriptet.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Medlet Route leverans Dosen för mus Varaktighet Anteckningar Källa Ref ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 ^ g / g 15-60 minuter Smal säkerhetsmarginal. Arbeta upp till rätt dos av anestesi långsamt. Tillägg 10% av induktion dos som behövs. 036.093; Butler Schein 7
Ketamin (Ketaset) blandat med Xylazine (Anased) IP 60 ^ g / g (K)
10 ^ g / g (x) (blandning i samma spruta)
20-30 minuter Xylazine samtidig injiceras som ett muskelavslappnande medel och smärtstillande. Tillägg bara Ketamin vid 50% av induktion dos som behövs. (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein 7
Isofluran (Isothesia) Inhalation 4% genomsnittlig alveolära koncentration (MAC) för induktion; 1-2% MAC för underhåll 4-6 timmar. Tillhandahålls i blandning av 70% syre och 30% kväveoxid. Långvarig anestesi leder till långsam återhämtning. 029.403; Butler Schein 26

Tabell 1. Föreslagna anestesimedel för överlevnad studier.

PUNKT FÖRETAG Katalog # / MODELL
Betadin Butler Schein 6906950
Buprenorfin (Buprenex) Butler Schein 031.919
Fluoresceinisotiocyanat dextran, 2 MDa molekylvikt Sigma FD2000S
Isopropylalkohol Fisher AC42383-0010
Lakterad Ringers lösning Butler Schein 009.846;
Lidokain lösning, 2% (volym / volym) Butler Schein 002.468
Saltlösning Butler Schein 009.861
Kirurgisk Mjölk Butler Schein 014.325
Texas Red dextran, 70 kDa molekylvikt Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035.646
ENGÅNGSARTIKLAR
Carbide grader, 1/2 mm munstycke Fina Science Tools 19.007-05
Hakat spets applikatorer Fisher Scientific 23-400-100
Täckglas, nej. 0 tjocklek Thomas Scientific 6661B40
Cyanoakrylatlim ND Industries 31.428 H04308
Gas dammtrasa Newegg N82E16848043429
Grip cementpulvret Dentsply 675.571
Grepp cement lösningsmedel Dentsply 675.572
Insulinspruta, 0,3 ml volym med 29,5 gauge Butler Schein 018.384
Mutter och bult för att fästa huvudet Digikey Mutter, H723-ND, bult, R2-56X1/4-ND
Oftalmisk salva Butler Schein 039.886
Skalpellblad Fisher Scientific 12-460-448
Skruvar, självgängande # 000 JI Morris Company FF000CE125
Silikon akvarium tätningsmedel Perfecto Manufacturing 31.001
Tennoxidpulvret Mammas Mineraler EQT-TINOX
UTRUSTNING
Glas skrivare Fisher Scientific 08-675
Dissektionsmikroskop Carl Zeiss OPMI-1 FC
Eldrivna borr Foredom eller Osada K.1020 (Foredom) eller EXL-M40 (Osada)
Elektrisk rakapparat Wahl Serie 8900
Tång, Dumont nej. 55 Fina Science Tools 11.255-20
Feedback reglerad värmekudde FHC 40-90-8 (rektal termistor, 40-90-5D-02, Häter pad, 40-90-2-07)
Isofluran förångaren Ohmeda IsoTec4
Pulsoximeter Starr Life Sciences MouseOx
Skruvmejsel, miniatyr Garret Wade 26B09.01
Stereotaktisk ram Kopf Instruments Modell 900 (med musen anestesi mask och icke-bristning örat bar)
Kirurgiska saxar, trubbig ände Fina Science Tools 14.078-10
Ultraljudsrengörare Fisher Scientific 15-335-30

Tabell 2. Förteckning över specifika reagens, förbrukningsmateriel och utrustning.

References

  1. Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
  2. Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in t....

Explore More Articles

Neuroscienceutg va 61kraniell f nsterkraniotomitv foton mikroskopiblodfl dedendritoptogeneticskortexkapill rmikrogliakroniskmus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved