Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Summary

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Abstract

In vivo beeldvorming van corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen, zonder verstoring van de intracraniële omgeving. We presenteren een methode om een ​​gepolijste en versterkte verdund schedel (poorten) venster te vormen in de muis schedel die enkele millimeters in diameter overspant en is stabiel voor maanden. De schedel verdund 10 tot 15 urn dik een draagbare boor optische helderheid bereiken en vervolgens bedekt met cyanoacrylaatlijm en een dekglas: 1) voorzien stijfheid, 2) remmen been hergroei en 3) te verminderen lichtverstrooiing onregelmatigheden op het botoppervlak. Omdat de schedel niet wordt doorbroken, is een ontsteking die het proces wordt bestudeerd van invloed kunnen zijn sterk verminderd. Imaging tot een diepte van 250 pm onder de corticale oppervlak kan worden bereikt met behulp van twee-foton laser scanning microscopie. Dit venster is zeer geschikt voor cerebrale doorbloeding en cellulaire functie te bestuderen in zowel onder narcose en wakker preparaten. Het biedt verder de opprima gelegenheid om cel-activiteit met behulp van optogenetics te manipuleren of de bloedstroom in gericht schepen verstoren door bestraling van circulerende fotosensitizers.

Protocol

1. Voorbereiding voor Chirurgie ⁱ

1. Maak de chirurgische instrumenten door sonicatie in een mengsel van Maxizyme en Chirurgische Melk in een ultrasone reiniger. Autoclaaf de chirurgische instrumenten voor elk experiment.
2. Zorg ervoor dat alle benodigde reagentia en disposables beschikbaar zijn. Een lijst van reagentia en disposables wordt gegeven in tabel 2. Reagentia en disposables die in contact komen met zichtbare weefsel moet steriel zijn, indien mogelijk.
3. Laten verdoving. Typi.......

Discussion

Twee-foton imaging door een ports raam vereist transmissie via de verdunde bot en de duur, dat het laserlicht verzwakt en voegt optische aberraties op grotere diepte ^8. Ondanks dit nadeel kan beeldvorming diepte van 250 pm onder het oppervlak pial worden bereikt met 900 nm excitatie. Grotere diepten beeldvorming kan in principe mogelijk meer excitatiegolflengten ^13. Een groot voordeel van deze methode is de afwezigheid van corticale ontsteking die tijdelijk zou kunnen bestaan ​​in methoden met .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agent	Route van levering	Dosis voor muis	Duur	Opmerkingen	Bron	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 mg / g	15-60 min	Smalle veiligheidsmarge. Werk om de juiste dosering van de anesthesie langzaam. Supplement 10% van de inductie-dosis nodig is.	036093; Butler Schein	7
Ketamine (Ketaset) gemengd met xylazine (Anased)	IP	60 pg / g (K) 10 pg / g (X) (mengsel in dezelfde injectiespuit)	20-30 min	Xylazine wordt mede geïnjecteerd als een spierverslapper en pijnstiller. Toeslag alleen Ketamine op 50% van inductiedosis zoals vereist.	(K) 010177, (X) 033.198; Butler Schein	7
Isofluraan (Isothesia)	Inademing	4% betekenen alveolaire concentratie (MAC) voor de inleiding; 1-2% MAC voor onderhoud	4-6 uur.	Geldt mengsel van 70% zuurstof en 30% lachgas. Langdurige anesthesie leidt tot langzamer herstel.	029403; Butler Schein	26

ITEM	BEDRIJF	catalogus # / MODEL
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorfine (Buprenex)	Butler Schein	031919
Fluoresceïne isothiocyanaat dextran, 2 MDa molecuulgewicht	Sigma	FD2000S
Isopropylalcohol	Visser	AC42383-0010
Ringer-lactaat oplossing	Butler Schein	009846;
Lidocaine oplossing, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Zoutoplossing	Butler Schein	009861
Chirurgische Milk	Butler Schein	014.325
Texas Red dextran, 70 kDa moleculair gewicht	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
DISPOSABLES
Carbide bramen, 1/2 mm formaat tip	Fine Science Tools	19007-05
Cottoned tip applicators	Fisher Scientific	23-400-100
Dekglas, nee. 0 dikte	Thomas Wetenschappelijk	6661B40
Cyanoacrylaatlijm	ND Industries	31428 H04308
Gas stofdoek	Newegg	N82E16848043429
Grip cementpoeder	Dentsply	675571
Grip cement oplosmiddel	Dentsply	675572
Insuline spuit, 0,3 ml volume met 29,5 naald	Butler Schein	018384
Moer en bout aan het hoofd vast	Digikey	Nut, H723-ND, bout, R2-56X1/4-ND
Opthalmic zalf	Butler Schein	039886
Scalpelmesjes	Fisher Scientific	12-460-448
Schroeven, zelftappende # 000	JI Morris Company	FF000CE125
Silicone aquarium kit	Perfecto Manufacturing	31001
Tin oxide poeder	Mama's Mineralen	EQT-TINOX
UITRUSTING
Glas schrijver	Fisher Scientific	08-675
Het ontleden van microscoop	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Elektrisch aangedreven boor	Foredom of Osada	K.1020 (Foredom) of EXL-M40 (Osada)
Elektrisch scheerapparaat	Wahl	Series 8900
Tang, Dumont nee. 55	Fine Science Tools	11255-20
Terugkoppeling gereguleerde warmte pad	FHC	40-90-8 (rectaal thermistor, 40-90-5D-02; heet pad, 40-90-2-07)
Isofluraan vaporizer	Ohmeda	IsoTec4
Pulsoximeter	Starr Life Sciences	MouseOx
Schroevendraaier, miniatuur	Garret Wade	26B09.01
Stereotaxisch frame	Kopf Instrumenten	Model 900 (met de muis anesthesie masker en niet-ruptuur oor bar)
Chirurgische schaar, stompe einde	Fine Science Tools	14078-10
Ultrasone reiniger	Fisher Scientific	15-335-30