Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

Summary

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Abstract

In vivo imaging della funzione corticale richiede l'accesso ottico al cervello senza interruzioni dell'ambiente intracranica. Vi presentiamo un metodo per formare un cranio lucido e rinforzato diluito (porte) finestra nel cranio del mouse che si estende su parecchi millimetri di diametro ed è stabile per mesi. Il cranio è diluito a 10 a 15 pm di spessore con una mano trapano per ottenere chiarezza ottica, e viene poi ricoperto con colla di cianoacrilato e un vetro di copertura a: 1) fornire rigidità, 2) inibiscono la ricrescita ossea e 3) ridurre la dispersione della luce da irregolarità sulla superficie dell'osso. Dal momento che il cranio non è violato, qualsiasi infiammazione che potrebbe influenzare il processo in fase di studio è notevolmente ridotto. Imaging profondità fino a 250 um sotto la superficie corticale può essere realizzato utilizzando due fotoni microscopia a scansione laser. Questa finestra è particolarmente adatta a studiare il flusso ematico cerebrale e la funzione cellulare in preparazioni sia anestetizzati e sveglio. Offre inoltre l'opportunità di manipolare l'attività delle cellule utilizzando optogenetics o per interrompere il flusso di sangue nei vasi destinatari irradiazione di circolazione fotosensibilizzanti.

Protocol

1. Preparazione per la chirurgia ⁱ

1. Pulire gli strumenti chirurgici dalla sonicazione in una miscela di latte Maxizyme e chirurgica in un pulitore ad ultrasuoni. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima di ogni esperimento.
2. Assicurarsi che tutti i reagenti necessari e monouso sono disponibili. Un elenco di reagenti e prodotti monouso è fornita in Tabella 2. Reagenti e monouso che vengono in contatto con il tessuto esposto deve essere sterile, quando possibile.
3. Indurre l'a.......

Discussion

Two-photon immagini attraverso una finestra Porte richiede la trasmissione attraverso l'osso assottigliata e la dura madre, che attenua la luce laser e aggiunge aberrazioni ottiche a maggiori profondità ^8. Tuttavia, nonostante questo inconveniente, profondità di imaging fino a 250 um sotto la superficie piale può essere ottenuto con eccitazione 900 nm. Profondità maggiori di imaging possono in linea di principio essere possibile con lunghezze d'onda di eccitazione più ^13. Un importante.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agente	Via di consegna	Dose per il mouse	Durata	Note	Fonte	Rif. Rif.
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Margine di sicurezza stretta. Lavorare fino a giusta dose di anestesia lentamente. Supplemento 10% della dose di induzione come richiesto.	036093; Butler Schein	7
Ketamina (Ketaset) miscelato con Xylazina (Anased)	IP	60 mcg / g (K) 10 pg / g (X) (in miscela stessa siringa)	20-30 min	Xilazina è co-iniettata come un rilassante muscolare e analgesico. Supplemento solo ketamina al 50% della dose di induzione come richiesto.	(K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein	7
Isoflurano (Isothesia)	Inalazione	4% concentrazione media alveolare (MAC) per l'induzione; 1-2% MAC per la manutenzione	4-6 h.	Purché in miscela di 70% di ossigeno e il 30% di ossido di azoto. L'anestesia prolungata porta a rallentare il recupero.	029403; Butler Schein	26

VOCE	AZIENDA	CATALOGO # / MODEL
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorfina (Buprenex)	Butler Schein	031919
Isotiocianato di fluorescina destrano, 2 MDa peso molecolare	Sigma	FD2000S
Alcol isopropilico	Pescatore	AC42383-0010
Soluzione di Ringer lattato	Butler Schein	009846;
Lidocaina soluzione, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Salino	Butler Schein	009861
Milk chirurgico	Butler Schein	014.325
Texas Red destrano, 70 kDa peso molecolare	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
MONOUSO
Carbide sbavature, ugello di dimensioni 1/2 mm	Strumenti di Scienze Belle	19007-05
Applicatori punta la foglia	Fisher Scientific	23-400-100
Vetro di copertura, no. 0 spessore	Thomas Scientific	6661B40
Colla di cianoacrilato	ND Industries	H04308 31428
Gas duster	Newegg	N82E16848043429
Grip di cemento in polvere	Dentsply	675571
Grip cemento solvente	Dentsply	675572
Insulina siringa, 0,3 mL di volume con il 29,5 gauge	Butler Schein	018384
Dado e bullone per fissare la testa	Digikey	Dado, H723-ND, bullone, R2-56X1/4-ND
Unguento oftalmico	Butler Schein	039886
Lame di bisturi	Fisher Scientific	12-460-448
Viti, autofilettante # 000	JI Morris Azienda	FF000CE125
Silicone sigillante acquario	Perfecto Manufacturing	31001
Tin polvere di ossido di	Mama Minerals	EQT-TINOX
ATTREZZATURE
Glass scriba	Fisher Scientific	08-675
Dissezione microscopio	Carl Zeiss	OPMI FC-1
Trapano elettrico alimentato	Foredom o Osada	K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada)
Rasoio elettrico	Wahl	Serie 8900
Pinza, Dumont no. 55	Strumenti di Scienze Belle	11255-20
Commenti pad termico regolamentato	FHC	40-90-8 (termistore rettale, 40-90-5D-02; hmangiare pad, 40-90-2-07)
Vaporizzatore isoflurano	Ohmeda	IsoTec4
Pulsossimetro	Starr Life Sciences	MouseOx
Cacciavite miniatura	Garret Wade	26B09.01
Telaio stereotassico	Kopf Instruments	Modello 900 (con maschera del mouse l'anestesia e non rottura barre di auricolari)
Forbici chirurgiche, fine blunt	Strumenti di Scienze Belle	14078-10
Pulitore ad ultrasuoni	Fisher Scientific	15-335-30