マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

Summary

我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。

Abstract

皮質機能のin vivoイメージングでは頭蓋内環境を中断することなく、脳への光アクセスする必要があります。我々は、直径数ミリメートルにまたがって、数ヶ月安定であるマウスの頭蓋骨で洗練された補強薄く頭蓋骨（ポート）ウィンドウを形成する手法を提案する。頭蓋骨は、光学的透明性を達成するためにドリルを開催し、シアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで覆われている手で厚さ10から15ミクロンまで薄くされています。1）剛性、2を提供する）、骨再生を阻害し、3）光散乱を低減する骨表面の凹凸から。頭蓋骨が破られていないので、検討されてプロセスに影響を与える可能性の炎症が大幅に削減されます。アップ皮質表面下250μmのへのイメージングの深さは、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて達成することができます。このウィンドウは、よく麻酔と覚醒の両方準備に脳血流と細胞機能を研究するのに適しています。それはさらにオペアンプを提供していますoptogeneticsを使用して、細胞の活性を操作するか、または循環する光感受性の照射により、標的血管の血流を妨害するportunity。

Protocol

1。手術の準備^I

1. 超音波洗浄器でMaxizymeと外科ミルクの混合物に超音波処理により手術器具をきれいにします。各実験前に、手術器具をオートクレーブします。
2. 必要なすべての試薬と消耗品が使用可能であることを確認してください。試薬や消耗品のリストを表2に記載されています。曝露された組織に接触した試薬および消耗品は、可能な場合は、無菌でなければなり?.......

Discussion

Portsウィンドウを介して2つの光子イメージングは薄く骨を介して伝送し、レーザ光 ​​を減衰させ、より大きな深さ⁸で光学収差を追加する硬膜を必要とします。しかし、この欠点にもかかわらず、軟膜表面下250μmでのイメージングの深さまでは900 nmの励起を実現することができます。大きな画像の深さは、原則的に¹³より長い励起波長を持つことも可能です。この方法の主?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
エージェント	配達の経路	マウスの用量	持続	注釈	ソース	refの文献
ペントバルビタール（ネンブタール）	IP	90μg/ gで	15〜60分間	狭い安全マージン。徐々に麻酔の適切な用量まで動作します。必要に応じて誘導量の10％を補う。	036093;バトラーシャイン	7
キシラジンと混合したケタミン（Ketaset）（Anased）	IP	60μg/ gで（K） 10μg/ gで（X）（同じ注射器でミックス）	20〜30分	キシラジンは、筋弛緩剤と鎮痛剤としての共同注入されます。必要に応じて誘導量の50％のみケタミン補う。	（K）010177、（X）033198;バトラーシャイン	7
イソフルラン（Isothesia）	吸入	4％の誘導のための肺胞内濃度（MAC）を意味し、メンテナンスのために1から2パーセントMAC	4〜6時間。	70％酸素と30％亜酸化窒素の混合物で提供される。長時間の麻酔は、回復を遅らせることにつながる。	029403;バトラーシャイン	26

ITEM	COMPANY	カタログ＃/ MODEL
Betadine	バトラーシャイン	6906950
ブプレノルフィン（Buprenex）	バトラーシャイン	031919
フルオレセインイソチオシアネートデキストラン、2 MDA分子量	シグマ	FD2000S
イソプロピルアルコール	フィッシャー	AC42383-0010
乳酸リンゲル液	バトラーシャイン	009846;
リドカイン溶液、2％（v / v）の	バトラーシャイン	002468
生理食塩水	バトラーシャイン	009861
手術のミルク	バトラーシャイン	014325
テキサスレッドデキストラン、70 kDaの分子量	インビトロジェン	D1864
Maxizyme	バトラーシャイン	035646
使い捨て
カーバイドバリ、1/2ミリメートルのチップサイズ	ファイン科学ツール	19007から05
Cottoned先端アプリケータ	フィッシャー·サイエンティフィック	23-400-100
いや、ガラスをカバーしています。 0厚さ	トーマス科学	6661B40
シアノアクリレート系接着剤	ND産業	31428 H04308
ガスダスター	Newegg	N82E16848043429
グリップセメント粉末	Dentsply	675571
グリップセメント溶剤	Dentsply	675572
インスリン注射器、29.5ゲージの針で0.3 mLの	バトラーシャイン	018384
頭を保護するためのナットとボルト	閲覧	ナット、H723-ND、ボルト、R2-56X1/4-ND
眼科軟膏	バトラーシャイン	039886
手術用メス	フィッシャー·サイエンティフィック	12-460-448
ねじ、セルフタッピング＃000	JIモリス会社	FF000CE125
シリコン水族館シーラント	パーフェクトマニュファクチャリング	31001
スズ酸化物粉末	ママの鉱物	EQT-TINOX
装置
ガラススクライブ	フィッシャー·サイエンティフィック	08から675
解剖顕微鏡	カールツァイス	OPMI-1 FC
電動ドリル	Foredomまたは長田	K.1020（Foredom）またはEXL-M40（長田）
電気かみそり	ウォール	シリーズ8900
鉗子、デュモンありません。 55	ファイン科学ツール	11255から20
フィードバック安定化された熱パッド	FHC	40-90-8（直腸サーミスタ、40から90-5D-02、H）パッド、40-90-2-07を食べる
イソフルラン気化器	Ohmeda	IsoTec4
パルス酸素濃度計	スターライフサイエンス	MouseOx
ミニチュア、ドライバー	ギャレット·ウェイド	26B09.01
定位フレーム	Kopfは楽器	モデル900（マウスの麻酔マスクと非破裂耳バー付き）
外科はさみ、平滑末端	ファイン科学ツール	14078から10
超音波洗浄器	フィッシャー·サイエンティフィック	15-335-30