마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

Summary

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

Abstract

생체내에서는 대뇌 피질 기능의 영상은 intracranial 환경의 방해없이 뇌로 광 액세스가 필요합니다. 우리는 직경 몇 mm에 걸쳐 그리고 수 개월 동안 안정 마우스 두개골에 광택과 철근 thinned 두개골 (포트) 윈도우를 구성하는 방법을 제시한다. 두개골이 광학 선명도를 달성하는 훈련을 실​​시 손으로 두께 10-15 μm의에 thinned하고 있으며, 다음으로 cyanoacrylate 접착제와 덮개 유리로 중첩됩니다 : 1) 강성, 2를 제공하는 것은) 뼈 regrowth을 억제하고 3) 빛의 산란을 감소 뼈 표면에 부정에서. 두개골이 터진 않았으므로, 공부중인 프로세스에 영향을 미칠 수있는 염증이 크게 줄어 듭니다. 최대 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의로의 이미징 깊이는 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 창문은 잘 anesthetized 정신 모두 준비에서 대뇌 혈류와 세포 기능을 공부하기 적합합니다. 그것은 더 이상 작전을 제공합니다portunity는 optogenetics를 사용하여 세포의 활동을 조작하거나 photosensitizers 순환의 조사의 대상이 혈관의 혈액 흐름을 방해한다.

Protocol

1. 수술 준비하기 ^전

1. 초음파 세척기의 Maxizyme, 외과 우유의 혼합물에 sonicating하여 수술 도구를 청소합니다. 각 실험 전에 수술 도구를 압력솥.
2. 필요한 모든 시약과 disposables를 사용할 수 있는지 확인합니다. 시약 및 disposables의 목록은 표 2에 제공됩니다. 가능하면 노출된 조직과 접촉 시약 및 disposables는 살균해야합니다.
3. 마취를 유도. 생존 연구에 적합한 일반 anesthetic.......

Discussion

두 광자 포트 창을 통해 영상은 레이저 빛을 attenuates하고 더 깊이 ⁸ 시에 광학 aberrations을 추가 thinned 뼈 및 경질 통해 전송을 필요로합니다. 그러나이 단점에도 불구하고 최대 pial 표면 아래 250 μm의에 이미징 깊이는 900 nm의 여기를 구현할 수 있습니다. 그레이터 이미징 깊이는 원칙적으로 ¹³ 이상 여기 파장과 수도 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 완전한 craniotomy ^{14, 15과}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
대리인	인도의 루트	마우스에 대한 선량	존속 기간	노트	출처	심판 심판
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 μg / g	15-60 분	좁은 여유가 없다. 천천히 마취의 적절한 복용량까지 작동합니다. 필요에 따라 유도 선량의 10 %를 보완.	036093; 버틀러 Schein	7
케타민을 (Ketaset)는 Xylazine (Anased) 섞인	IP	60 μg / G (K) 10 μg / g (X) (동일 주사기에 혼합)	20-30 분	Xylazine는 근육 이완 및 진통제로 공동 주입된다. 필요에 따라 유도 선량의 50 %에서만 케타민을 보완.	(K) 010177, (X) 033,198; 버틀러 Schein	7
Isoflurane (Isothesia)	흡입	4 % 유도를위한 폐포 농도 (MAC)을 의미, 유지 보수 1-2% MAC	4-6 H.	70 % 산소 30 % 질소 산화물의 혼합물로 제공. 장시간 마취 회복을 늦추기 위해 이끌고 있습니다.	029403; 버틀러 Schein	26

ITEM	회사	카탈로그 # / 모델
Betadine	버틀러 Schein	6,906,950
Buprenorphine (Buprenex)	버틀러 Schein	031,919
플루오레신 isothiocyanate dextran, 2 MDA 분자량	시그마	FD2000S
이소 프로필 알코올	어부	AC42383-0010
Lactated 울리는의 솔루션	버틀러 Schein	009846;
Lidocaine 용액, 2 % (V / V)	버틀러 Schein	002,468
식염	버틀러 Schein	009,861
외과 우유	버틀러 Schein	014,325
텍사스 레드 dextran, 70 kDa 분자량	Invitrogen	D1864
Maxizyme	버틀러 Schein	035,646
DISPOSABLES
초경 털은, 1 / 2mm 팁 크기	파인 과학 도구	19007-05
Cottoned 팁 applicators	피셔 과학	23-400-100
유리, 아니 보호해. 0 두께	토마스 과학	6661B40
Cyanoacrylate 접착제	ND 산업	31,428 H04308
가스 살포기	Newegg	N82E16848043429
그립 시멘트 분말	Dentsply	675,571
그립 시멘트 용매	Dentsply	675,572
인슐린 주사기, 29.5 게이지 바늘로 0.3 ML 볼륨	버틀러 Schein	018,384
너트와 머리를 고정 볼트	Digikey	너트, H723-ND, 볼트, R2-56X1/4-ND
Opthalmic 연고	버틀러 Schein	039,886
메스 블레이드	피셔 과학	12-460-448
나사, 셀프 태핑 # 000	JI 모리스 회사	FF000CE125
실리콘 수족관 밀봉 재	완벽 제조	31,001
주석 산화물 분말	엄마의 광물	EQT-TINOX
장비
유리 학자	피셔 과학	08-675
현미경 해부	칼 자이스 혈구	OPMI-1 FC
전기 파워 드릴	Foredom 또는 Osada	K.1020 (Foredom) 또는 EXL-M40 (Osada)
전기 면도기	Wahl	시리즈 8900
집게, 뒤몽 안돼. 55	파인 과학 도구	11255-20
피드백 조절 열 패드	FHC	40-90-8 (직장 써미스터, 40 - 90 5D-02, H) 패드, 40-90-2-07 먹어
Isoflurane 기화기	Ohmeda	IsoTec4
펄스 산소 농도계	스타 생명 과학	MouseOx
미니어처, 드라이버	가렛 웨이드	26B09.01
Stereotaxic 프레임	Kopf 인 스트 루먼트	모델 900 (마우스 마취 마스크와 비 파열 귀에 바 있음)
외과 가위, 무딘 끝	파인 과학 도구	14078-10
초음파 세척기	피셔 과학	15-335-30