A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Summary

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

Abstract

In vivo de imagem da função cortical requer acesso óptico para o cérebro sem interrupção do ambiente intracraniana. Nós apresentamos um método para formar um crânio polido e reforçado diluído (portas) janela no crânio do rato que se estende por vários milímetros de diâmetro e é estável durante meses. O crânio é diluído para 10 a 15 uM de espessura com uma mão de broca para alcançar claridade óptica, e é então revestida com cola de cianoacrilato e uma tampa de vidro para: 1) proporcionar rigidez, 2) inibir crescimento do osso e 3) reduzir a dispersão de luz a partir de irregularidades na superfície do osso. Uma vez que o crânio não seja ultrapassado, qualquer inflamação que pode afetar o processo que está sendo estudado é bastante reduzido. Profundidades de imagem de até 250 uM abaixo da superfície cortical pode ser conseguido usando dois-fotão microscopia laser scanning. Esta janela é bem adequado para estudar o fluxo sanguíneo cerebral e da função celular, tanto em preparações anestesiados e acordado. Além disso, oferece a optunidade para manipular a atividade das células usando optogenetics ou para interromper o fluxo de sangue nos vasos alvo de irradiação de fotossensibilizadores circulando.

Protocol

1. Preparação para Cirurgia ⁱ

1. Limpe os instrumentos cirúrgicos por sonicação em uma mistura de leite Maxizyme e cirúrgica em um líquido de limpeza ultra-sônica. Autoclavar os instrumentos cirúrgicos, antes de cada experiência.
2. Assegurar que todos os reagentes necessários e descartáveis ​​estão disponíveis. Uma lista de reagentes e produtos descartáveis ​​é fornecido na Tabela 2. Reagentes e produtos descartáveis ​​que entram em contacto com o tecido exposto de.......

Discussion

Dois fótons de imagens através de uma janela Portas exige transmissão através do osso diluído e dura-máter, que atenua a luz do laser e adiciona aberrações ópticas em profundidades maiores ^8. No entanto, apesar de este inconveniente, a profundidade de imagem até 250 um abaixo da superfície pial pode ser conseguido com 900 nm de excitação. Maiores profundidades de imagem podem, em princípio, seria possível com comprimentos de onda mais longos de excitação ^13. Uma grande vantagem des.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agente	Via de parto	Dose para mouse	Duração	Notas	Fonte	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Estreita margem de segurança. Trabalhe até a dose adequada de anestesia lentamente. Suplemento de 10% da dose de indução, conforme necessário.	036093; Butler Schein	7
Ketamina (Ketaset) misturado com Xilazina (Anased)	IP	60 ug / g (K) 10 mg / g (X) (mistura na mesma seringa)	20-30 min	Xilazina é co-injetado como um relaxante muscular e analgésico. Suplemento apenas Cetamina menos 50% da dose de indução, conforme necessário.	(K) 010,177, (X) 033,198; Butler Schein	7
Isoflurano (Isothesia)	Inalação	4% significa a concentração alveolar (MAC) para a indução; 1-2% MAC para manutenção	4-6 h.	Fornecidas em mistura de oxigénio de 70% e 30% de óxido nitroso. Anestesia prolongada leva a retardar a recuperação.	029403; Butler Schein	26

ITEM	EMPRESA	catalogo MODELO /
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorfina (Buprenex)	Butler Schein	031919
Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 peso molecular MDa	Sigma	FD2000S
Álcool isopropílico	Pescador	AC42383-0010
Solução de Ringer com lactato	Butler Schein	009846;
Solução de lidocaína, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Salina	Butler Schein	009861
Leite cirúrgico	Butler Schein	014325
Texas Red dextrano, 70 kDa de peso molecular	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
Descartáveis
Carbide rebarbas, tamanho do bico 1/2 mm	Belas Ferramentas Ciência	19007-05
Cottoned aplicadores ponta	Fisher Scientific	23-400-100
Tampa de vidro, não. 0 espessura	Thomas Scientific	6661B40
Cola de cianoacrilato	ND Indústrias	31428 H04308
Espanador de gás	Newegg	N82E16848043429
Pó de cimento aderência	Dentsply	675571
Punho de cimento solvente	Dentsply	675572
Seringa de insulina, 0,3 ml de volume com 29,5 agulha de calibre	Butler Schein	018384
Porcas e parafusos para fixar a cabeça	Digikey	Nut, H723-ND; parafuso, R2-56X1/4-ND
Pomada oftálmica	Butler Schein	039886
Lâminas de bisturi	Fisher Scientific	12-460-448
Parafusos, self-tapping # 000	JI Empresa Morris	FF000CE125
Selante de Silicone para aquário	Perfecto Manufacturing	31001
Pó de óxido de estanho	Minerais Mama	EQT-TINOX
EQUIPAMENTO
Escriba de vidro	Fisher Scientific	08-675
Microscópio de dissecção	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Broca elétrico movido a	Foredom ou Osada	K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada)
Navalha elétrica	Wahl	Série 8900
Fórceps, Dumont não. 55	Belas Ferramentas Ciência	11255-20
Comentários almofada térmica regulada	FHC	40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer pad, 40-90-2-07)
Vaporizador de isoflurano	Ohmeda	IsoTec4
Oxímetro de pulso	Starr Ciências da Vida	MouseOx
Chave de fenda, em miniatura	Garret Wade	26B09.01
Estereotáxica	Kopf Instruments	Modelo 900 (com máscara de rato anestesia e não-ruptura barras de ouvido)
Tesoura cirúrgica, ponta romba	Belas Ferramentas Ciência	14078-10
Limpador ultra-sônico	Fisher Scientific	15-335-30