Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши

Summary

Представлен метод формирования изображения окна в мышь череп, который охватывает миллиметров и стабилен в течение месяца без воспаление головного мозга. Этот метод хорошо подходит для продольного исследования кровотока, клеточной динамики, и клетка / сосудистые структуры с использованием двух-фотонной микроскопии.

Abstract

В естественных изображений корковых функций требует оптического доступа к мозгу без нарушения внутричерепного окружающей среды. Представлен метод формирования полированного и железобетонных разбавленной черепа (портов) в окно мыши череп, который охватывает несколько миллиметров в диаметре и стабилен в течение месяца. Череп разбавленной от 10 до 15 мкм в толщину с ручной буровой для достижения оптической прозрачностью, а затем обложил цианакрилатного клея и покровного стекла: 1) обеспечивает жесткость, 2) подавляют костный подроста и 3) уменьшить рассеяние света от неровностей на поверхности кости. С черепа не нарушена, любое воспаление, которое может повлиять на процесс изучается значительно снижается. Изображений глубине до 250 мкм ниже поверхности коры может быть достигнуто с помощью двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии. Это окно хорошо подходит для изучения мозгового кровотока и клеточной функции как наркоз и проснуться препаратов. Кроме того, он предлагает опможность управлять клеточной активности использования optogenetics или нарушать кровоток в сосудах целевых облучения циркулирующего фотосенсибилизаторов.

Protocol

1. Подготовка к операции ^я

1. Очистите хирургических инструментов, sonicating в смеси Maxizyme и хирургических молока в ультразвуковой очиститель. Автоклава хирургические инструменты перед каждым экспериментом.
2. Убедитесь, что все необходимые реагенты и расходные материалы имею?.......

Discussion

Двухфотонного изображений через окно портов требует передачи через разбавленной костей и твердой мозговой оболочкой, которая ослабляет свет лазера и добавляет оптических аберраций на больших глубинах ^8. Однако, несмотря на этот недостаток, изображения глубиной до 250 мкм ниже пи?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Агент	Маршрут доставки	Доза для мыши	Продолжительность	Примечания	Источник	Работы работы
Фенобарбитала (Nembutal)	IP	90 мкг / г	15-60 мин	Ограниченный запас прочности. Работа до надлежащую дозу наркоза медленно. Дополнение 10% от индукционной дозы по мере необходимости.	036093, Шейн Батлер	7
Кетамин (Ketaset), смешанного с Ксилазин (Anased)	IP	60 мкг / г (К) 10 мкг / г (X) (соединение в одном шприце)	20-30 мин	Ксилазин совместно вводят как мышечный релаксант и анальгетик. Дополнение только кетамина на 50% индукции дозу по мере необходимости.	(K) 010177, (X) 033198; Шейн Батлер	7
Изофлюран (Isothesia)	Вдыхание	4% означает, альвеолярной концентрации (ПДК) для индукции; 1-2% MAC для обеспечения	4-6 часов.	Предоставляется в смеси из 70% кислорода и 30% закиси азота. Длительная анестезия приводит к медленному восстановлению.	029403, Шейн Батлер	26

ПУНКТ	КОМПАНИИ	КАТАЛОГ # / МОДЕЛЬ
Бетадин	Шейн Батлер	6906950
Бупренорфин (Buprenex)	Шейн Батлер	031919
Флуоресцеина изотиоцианат декстран, 2 МДа молекулярной массой	Сигма	FD2000S
Изопропиловый спирт	Рыбак	AC42383-0010
Лактата раствор Рингера	Шейн Батлер	009846;
Раствор лидокаина, 2% (объем / объем)	Шейн Батлер	002468
Солевой	Шейн Батлер	009861
Хирургическое молока	Шейн Батлер	014325
Texas Red декстрана 70 кДа молекулярной массой	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Шейн Батлер	035646
Расходные материалы
Карбида заусенцев, 1/2 мм размер сопла	Изобразительных средств наук	19007-05
Cottoned аппликаторы наконечник	Fisher Scientific	23-400-100
Крышка стекла, нет. 0 толщины	Томас Научно	6661B40
Цианакрилатный клей	ND промышленности	31428 H04308
Газ тряпкой	Newegg	N82E16848043429
Порошок сцепление цемента	Dentsply	675571
Сцепление цементного растворителя	Dentsply	675572
Инсулиновый шприц, объемом 0,3 мл с иглой 29,5	Шейн Батлер	018384
Гайку и болт для обеспечения головы	Конденсаторы	Орех, H723-ND, болт, R2-56X1/4-ND
Офтальмология мазь	Шейн Батлер	039886
Скальпель лезвия	Fisher Scientific	12-460-448
Винты, саморезы # 000	СО Morris компании	FF000CE125
Силиконовый герметик аквариум	Производство Perfecto	31001
Порошок оксида олова	Мама Минералов	EQT-TINOX
ОБОРУДОВАНИЕ
Стекло писец	Fisher Scientific	08-675
Препаровальная лупа	Carl Zeiss	OPMI FC-1
Электрическая дрель	Foredom или Осада	K.1020 (Foredom) или EXL-M40 (Осада)
Электрическая бритва	Wahl	Серия 8900
Пинцет, Дюмон нет. 55	Изобразительных средств наук	11255-20
Обратная связь регулируемой площадке тепло	FHC	40-90-8 (ректальные термистор, 40-90-5D-02, честь площадки, 40-90-2-07)
Изофлюран испаритель	Ohmeda	IsoTec4
Пульсоксиметр	Старр наук о жизни	MouseOx
Отвертка, миниатюрные	Гаррет Уэйд	26B09.01
Стереотаксической кадров	Kopf Instruments	Модель 900 (с помощью мыши маска анестезией и не разрыв уха бары)
Хирургические ножницы, тупым концом	Изобразительных средств наук	14078-10
Ультразвуковой очиститель	Fisher Scientific	15-335-30