En polerad och förstärkt Gallrad-skalle Fönster för långsiktig Imaging för mus Brain

Summary

Vi presenterar en metod för att bilda en avbildning fönster i mus skalle som sträcker sig över millimeter och är stabil under månader utan inflammation av hjärnan. Denna metod lämpar sig väl för longitudinella studier av blodflödet, cellulära dynamik, och cell / vaskulär struktur genom att använda två-foton-mikroskopi.

Abstract

Avbildning in vivo av kortikalt funktion kräver optisk tillgång till hjärnan utan störning av den intrakraniala miljön. Vi presenterar en metod för att bilda en polerad och förstärkt förtunnad skallen (portar) fönster i musen skallen som spänner över flera millimeter i diameter och är stabil i månader. Skallen förtunnas till 10 till 15 pm i tjocklek med en handburen borrmaskin för att uppnå optisk klarhet, och därefter täcktes med cyanoakrylatlim och ett täckglas för att: 1) ger styvhet, 2) inhibera benåterväxt och 3) reducera ljusspridning av oegentligheter på benet ytan. Eftersom skallen inte överskrids, är någon inflammation som kan påverka processen som studeras kraftigt. Bildgivande djup på upp till 250 pm under den kortikala ytan kan åstadkommas med användning av två-foton-mikroskopi laserskanning. Detta fönster är väl lämpad för att studera cerebralt blodflöde och cellulär funktion i både sövda och vakna beredningar. Det erbjuder ytterligare ophet att manipulera cellaktivitet med användning optogenetics eller att störa blodflödet i målinriktade kärl genom bestrålning av cirkulerande fotosensibilisatorer.

Protocol

1. Förberedelser för Kirurgi ⁱ

1. Rengör de kirurgiska verktyg genom ultraljudsbehandling i en blandning av Maxizyme och kirurgiska mjölk i ett ultraljud renare. Autoklavera kirurgiska verktyg innan varje experiment.
2. Se till att alla nödvändiga reagenser och förbrukningsvaror finns tillgängliga. En lista av reagens och engångsmaterial tillhandahålls i tabell 2. Reagens och engångsmaterial som kommer i kontakt med exponerad vävnad bör vara steril, om möjligt.
3. Inducera .......

Discussion

Två-foton-avbildning genom en PORTS fönster kräver transmission genom den förtunnade benet och dura, som dämpar det laserljus och adderar optiska aberrationer på större djup ^8. Trots denna nackdel, kan avbildning djup upp till 250 pm under pial ytan uppnås med 900 nm excitering. Större imaging djup kan i princip vara möjligt med längre exciteringsvåglängder ^13. En stor fördel med denna metod är avsaknaden av kortikala inflammation som kan finnas övergående i metoder innebär full k.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medlet	Route leverans	Dosen för mus	Varaktighet	Anteckningar	Källa	Ref ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ^ g / g	15-60 minuter	Smal säkerhetsmarginal. Arbeta upp till rätt dos av anestesi långsamt. Tillägg 10% av induktion dos som behövs.	036.093; Butler Schein	7
Ketamin (Ketaset) blandat med Xylazine (Anased)	IP	60 ^ g / g (K) 10 ^ g / g (x) (blandning i samma spruta)	20-30 minuter	Xylazine samtidig injiceras som ett muskelavslappnande medel och smärtstillande. Tillägg bara Ketamin vid 50% av induktion dos som behövs.	(K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein	7
Isofluran (Isothesia)	Inhalation	4% genomsnittlig alveolära koncentration (MAC) för induktion; 1-2% MAC för underhåll	4-6 timmar.	Tillhandahålls i blandning av 70% syre och 30% kväveoxid. Långvarig anestesi leder till långsam återhämtning.	029.403; Butler Schein	26

PUNKT	FÖRETAG	Katalog # / MODELL
Betadin	Butler Schein	6906950
Buprenorfin (Buprenex)	Butler Schein	031.919
Fluoresceinisotiocyanat dextran, 2 MDa molekylvikt	Sigma	FD2000S
Isopropylalkohol	Fisher	AC42383-0010
Lakterad Ringers lösning	Butler Schein	009.846;
Lidokain lösning, 2% (volym / volym)	Butler Schein	002.468
Saltlösning	Butler Schein	009.861
Kirurgisk Mjölk	Butler Schein	014.325
Texas Red dextran, 70 kDa molekylvikt	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035.646
ENGÅNGSARTIKLAR
Carbide grader, 1/2 mm munstycke	Fina Science Tools	19.007-05
Hakat spets applikatorer	Fisher Scientific	23-400-100
Täckglas, nej. 0 tjocklek	Thomas Scientific	6661B40
Cyanoakrylatlim	ND Industries	31.428 H04308
Gas dammtrasa	Newegg	N82E16848043429
Grip cementpulvret	Dentsply	675.571
Grepp cement lösningsmedel	Dentsply	675.572
Insulinspruta, 0,3 ml volym med 29,5 gauge	Butler Schein	018.384
Mutter och bult för att fästa huvudet	Digikey	Mutter, H723-ND, bult, R2-56X1/4-ND
Oftalmisk salva	Butler Schein	039.886
Skalpellblad	Fisher Scientific	12-460-448
Skruvar, självgängande # 000	JI Morris Company	FF000CE125
Silikon akvarium tätningsmedel	Perfecto Manufacturing	31.001
Tennoxidpulvret	Mammas Mineraler	EQT-TINOX
UTRUSTNING
Glas skrivare	Fisher Scientific	08-675
Dissektionsmikroskop	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Eldrivna borr	Foredom eller Osada	K.1020 (Foredom) eller EXL-M40 (Osada)
Elektrisk rakapparat	Wahl	Serie 8900
Tång, Dumont nej. 55	Fina Science Tools	11.255-20
Feedback reglerad värmekudde	FHC	40-90-8 (rektal termistor, 40-90-5D-02, Häter pad, 40-90-2-07)
Isofluran förångaren	Ohmeda	IsoTec4
Pulsoximeter	Starr Life Sciences	MouseOx
Skruvmejsel, miniatyr	Garret Wade	26B09.01
Stereotaktisk ram	Kopf Instruments	Modell 900 (med musen anestesi mask och icke-bristning örat bar)
Kirurgiska saxar, trubbig ände	Fina Science Tools	14.078-10
Ultraljudsrengörare	Fisher Scientific	15-335-30