פרי ניתוח נדיפים באמצעות האף האלקטרוני

Summary

השיטה המהירה לניתוח מתחם נדיפים בפרי מתואר. התרכובות נדיפים הנמצאים אמיץ של homogenate המדגם מופרדות במהירות זוהה עם כרומטוגרפיה אולטרה מהיר גז (GC) יחד עם גל משטח אקוסטי (SAW) חיישן. נוהל לטיפול נתונים וניתוח נדון גם.

Abstract

שינויים פיזיולוגיים רבים ומגוונים להתרחש במהלך הבשלת הפרי, כולל פיתוח של תערובת תנודתי ספציפי המאפיין את ניחוח הפרי. לפדיון על הקציר הוא אחד הגורמים המרכזיים המשפיעים על איכות הטעם של פירות וירקות ^1. אימות של שיטות חזקים כי במהירות להעריך בגרות פירות איכות ארומה תאפשר ניהול משופר של תוכניות רבייה מתקדמות, שיטות ייצור וטיפול postharvest.

בשלושת העשורים האחרונים, מחקר רב נערך לפתח מה שנקרא אפים אלקטרוניים, שהם מכשירים המסוגלים לזהות במהירות ריחות וטעמים ^2-4. כרגע יש כמה אפים אלקטרוניים מסחריים מסוגל לבצע ניתוח נדיף, המבוססים על טכנולוגיות שונות. האף האלקטרוני המשמשים את העבודה שלנו (zNose, EST, ניוברי פארק, קליפורניה, ארה"ב), כולל כרומטוגרפיה אולטרה מהיר הגז יחד עם חיישן אקוסטי פני גל (UFGC-וירא). טכנולוגיה זו כבר נוסתה על יכולתה לפקח על איכות של סחורות שונות, כולל זיהוי של הידרדרות אפל ^5, בשלות והערכה של ריקבון מנגו ^6; פרופיל ארומה של מינים התימוס ^7: C ₆ תרכובות נדיפות של גרגרי הענבים ^8; אפיון שמן צמחי ⁹ וזיהוי של adulterants בשמן קוקוס בתולה ^10.

מערכת זו ניתן לבצע את שלושת השלבים העיקריים של ניתוח ארומה: אמיץ את הדגימה, הפרדת חומרים נדיפים, וזיהוי. אחרי דקה אחת, פלט, הכרומתוגרמה, מופק, לאחר מחזור הקאה, המכשיר מוכן לניתוח נוסף. התוצאות שהושגו עם zNose אפשר להשוות לאלה של גז chromatographic מערכות אחרות של חישוב מדדי Kovats (KI). פעם אחת המכשיר כבר מכוון את הפתרון הסטנדרטי בספירה הכללית, זמני השמירה הם הופכים אוטומטיתכיס. עם זאת, שינויים קלים הטמפרטורה וקצב הזרימה צפויים להתרחש לאורך זמן, גורמת פעמים שמירה להיסחף. כמו כן, בהתאם הקוטביות של שלב עמודה נייח, שחזור של חישובים קי יכול להשתנות על ידי יחידות ראשי מספר ^11. סדרה של תוכניות וממשקים גרפיים פותחו ולכן להשוות בין דגימות כיס מחושבים באופן אוטומטי למחצה. תוכניות אלה להפחית את הזמן הנדרש לניתוח הכרומתוגרמה של ערכות נתונים גדולות לצמצם את הסיכון מוטעה של הנתונים כאשר chromatograms לא מיושרים באופן מושלם.

אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר מתחם נדיפים בפרי. , הכנת נתונים רכישה וטיפול נהלים לדוגמה הם דנו גם.

Protocol

1. לדוגמא הכנת

1. קציר פירות בשלב הבגרות הרצויה. יש לשטוף במי ברז על מנת להסיר לכלוך ואבק.
2. בחר פירות לניתוח על בסיס היעדר פגמים חיצוניים ופנימיים, והומוגניות גודל.
3. חותכים פירות longitudinally לתוך פלחי כדי לשמש הדגימה תנודתי. במידת הצורך, להסיר את העור, זרעים, חלל רקמת זרע, או בור. רקמת מבחר פירות חייב להיות עקבי לאורך כל הניסוי ולקחת בחשבון את השונות בתוך פירות אחת (כלומר, להשיג מדגם לא פחות מ לפרוח, המשוונית ולסיים חלקי גזע).
4. מערבבים את רקמת הפרי הנבחר, לערבב את זה כדי באקראי, ואז לשקול את 200 גרם לתוך בלנדר.
5. הוסף 200 מ"ל של תמיסת CaCl ₂ רווי (372.5 גרם ב 20 ° C, 500 מ"ל מים deionized) ו 50 μL של פתרון של 100 מ"מ 2-methylbutyl isovalerate של מתנול. ₂ CaCl נועד לשמש מעכב של AC האנזימטיתtivity, שעלולה להתרחש לאחר חיתוך שמאחד את בשר הפרי. 2-Methylbutyl isovalerate נוסף כסטנדרט פנימי לפקח על כל ההפסדים האפשריים של חומרים נדיפים בתהליך homogenization.
6. Homogenize התערובת בבלנדר במעבדה (וארינג, ארה"ב), למשך 30 שניות ב -18,000 סל"ד, ומיד שופכים לתוך בקבוק זכוכית חותם עם מכסה טפלון. שמור homogenate בבקבוק בטמפרטורת החדר עד שכל דגימות מוכנים.
7. לאחר שמזג homogenate לתוך הבקבוק, להמתין 10 דקות כדי לאפשר הפרדה בין הקצף מנוזל, אז פיפטה 5 מ"ל של נוזל aliquots, ללא קצף, תוך 20 מ"ל צלוחיות זכוכית ענבר ולאטום את צלוחיות עם ראשי ברגים פלדה מצויד טפלון / סיליקון septa. הליך זה מתאים מלון והכנת homogenate אגס. אם פירות אחרים משמשים לניתוח, צעד צנטריפוגה, ייתכן שיהיה צורך. לכן, להסיר את הקצף ואז בצנטריפוגה נוזל החלקיקים גלולה כי אולילחסום פיפטה. הכינו לפחות שלוש צלוחיות לפי המדגם לשמש טכנית משכפל.
8. בשלב זה, דגימות יכול להיות מנותח באופן מיידי או פלאש קפואים בחנקן נוזלי ומאוחסנים בטמפרטורה נמוכה במיוחד (-80 ° C) לצורך ניתוח מאוחר יותר.
9. עבור דגימות קפואות, ביום הניתוח להסיר את הדגימות מהמקפיא ולאפשר להם להפשיר במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר ההפשרה, ולפני הניתוח, להחליף את מכסה בקבוקון עם אחד חדש שיש לו מחצה נקייה ויבשה. אם מחצה אינו מוחלף, המים מתעבים על מחצה במהלך ההפשרה יכול להימשך אל המכשיר ולפגוע בו.

2. כרומטוגרפיה משטח גז גל אקוסטי (GC-SAW) הקמה רכישת נתונים

1. טען את שיטת הניתוח המתאים zNose.
   לצורך ניתוח של פרופיל, אסתר עשיר נדיף של מלון, הפרמטרים שלנו בגירסה MicroSense 5.44.22 תוכנה (ניוברי פארק, קליפורניה, ארה"ב) הם כדלקמן: שאיבה אמיץ אלכניסת למשך 20 שניות בכל 30 מ"ל דקות ^-1 באמצעות משאבה; טמפרטורת כניסת ב 200 מעלות צלזיוס, טמפרטורה Tenax מלכודת ב 225 מעלות צלזיוס; ספיקת הגז המוביל (טוהר הליום 99.999%) של 2.9 מ"ל דקות-1, עמודה (DB-5 הטור, 1 מ '× 0.25 × 0.25mm מזהה הסרט עובי מיקרומטר) תוכנית הטמפרטורה מ 45 ° C עד 180 ° C בקצב של 10 ° C sec ^-1; חיישן הטמפרטורה על 40 מעלות צלזיוס; שסתום ב 165 ° C. זמן הניתוח הכולל הוא 1 דקה לדגימה.
2. חבר מחט נירוסטה עם קצה שאינם מגלענת כדי כניסת zNose ולטהר את המערכת כמה פעמים עם אוויר הסביבה, עד לקו הבסיס הוא יציב ולא שיאים גדולים יותר מ -200 ספירות (CT) מזוהים.
3. לכוון את המכשיר באמצעות פתרון של אלקאנים שרשרת ישר (C6-C14). בעקבות המנגינה משמש את תוכנת המכשיר כדי להמיר את זמן השמירה של פסגות eluted בין יחידות הזמן לתוך Kovats אינדקס (KI) יחידות. כתוצאה מכך, לאחר מערכת מכוון, זמני השמירה מדווחים יחידות קי.
4. לפני ניתוח, מאפשרים המדגם כדי לאזן במשך 30 דקות. לנתח אחד צלוחיות לדוגמה, להכניס מחט מחצה את הבקבוקון כדי לשחרר את הלחץ. לאחר מכן, הכנס את המחט מחוברת כניסת מכשיר לתוך מחצה את הבקבוקון וליזום הדגימה אמיץ. ניתוח טכני לפחות 3 משכפל לדגימה.
5. באופן ידני להפעיל את המכשיר על ידי לחיצה על כפתור "הפעל", מפעיל משאבת ומסלקת את אדי מציגים מעל המדגם. בסופו של הניתוח, הכרומתוגרמה מופיע על המסך, חיישן מחומם באופן אוטומטי עד 150 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות לנקות את זה. כאשר מצב המערכת כפתור תיבת הופך ירוק שוב, המכשיר מוכן לנתח דוגמה נוספת.
6. על מנת להבטיח בסיס יציב ניקוי מערכת נכונה, הפעל לפחות אחד ריק אוויר בין מדגם זה. כדי לפקח על זיהום אפשרי תנודתי מבקבוקון וכובע, לנתח שני בקבוקון למוצרי החסר (בקבוקון ריק עם מכסה), בתחילת ובסוף היום.

3. ייצוא נתונים וניתוח

1. לייצא את הנתונים לתוך קובץ של Microsoft Excel לאחר הרכישה באמצעות "רישום שיא" פונקציה בתוכנה MicroSense. לאחר הנתונים מיוצאים, להוסיף עמודות המכילים תוויות של משתנים משכפל.
2. לשנות את תבנית נתונים למניפולציה קלה באמצעות Python (גרסה 2.6, זמין בחינם מקוון) התסריט שפיתחנו, בשם "reform_data.py" (ראה איור 1 למשל של לעצב את הנתונים לפני ואחרי השימוש סקריפט "reform_data. py "). שמו של קובץ המקור (בפורמט xls) ואת שם הגיליון עבור נתוני הקלט, כמו גם את שם הקובץ הרצוי עבור פלט (בפורמט xls), הם עריכה ישירה לתוך התסריט.
3. התחל "kim_interface.py" (שנכתב גם Python 2.6, ראה איור 2), ולייבא את הנתונים מקובץ שנוצר בשלב הקודם. באופן ספציפי, הניתוח מבוסס על צפייה וניתוח כמה פעמים כל ערך KI היה שזוהו("להיטים קי"). לכן התוכנית מציגה גרף עמודות של להיטים קי עבור כל ערך KI.
4. להעריך את הלהיטים קי של תת קבוצות ספציפיות של דגימות, ניתוח טכני של כל קבוצה משכפל יחד. לשם כך, לנתח כל טיפול או משתנה בנפרד על ידי סימון / ביטול הסימון בתיבות המתאימות. ראה איור 2 הכיתוב על תיאור מפורט של ממשק המשתמש (GUI) תכונות גרפי.
5. לאחר זיהוי רוחב של חלון אחד KI משתמש GUI, בחר באופן אקראי חלק chromatograms המתאימים תוכנה Microsense ולהעריך חפיפה בין פסגות טכנית משכפל. ראה איור 3 לדוגמה של chromatograms כיסו של 2 הטכני משכפל.
6. לאחר חלון KI הוא individuated, השתמש בתכונת זמין "מיזוג" ב GUI למזג את כיס שנופלים בחלון, אל KI המאוכלס ביותר. באמצעות תכונה זו, פסגות שכותרתו עם מגוון של ערכים קי מאוחדים תחת המותג KI אחד, allowing בטיפול פסגות כגון משתנה אחד.
   לשם כך, תחילה לחץ על הכפתור "מיזוג" כדי להפעיל את התכונה ובחר KI המאוכלס ביותר כמרכז של החלון על ידי לחיצה על השמאלי בשורת המקביל. לאחר שסרגל נבחר, הוא משנה צבע לירוק. כדי למזג את כיס שנופלים בתוך החלון לתוך KI שנבחר, לחץ לחיצה ימנית על הסורגים המקביל; זה גורם הסורגים להאדים, בעוד בר כחול באורך המתאים מתווסף על גבי KI המרכזית (ראה איור 4 ). לאחר כל כיס נבחרים מוזגו לתוך KI המרכזי המתאים, לחץ על הכפתור "מיזוג" שוב כדי לקבל את השינויים, זה גורם כפתור "מיזוג" להפוך את הצהוב. במקרה של טעויות, לחצן "ביטול מיזוג" הוא גם זמין. כדי ביטול מיזוג, לחץ על כפתור "ביטול מיזוג" ב-GUI, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על סרגל אדום אתה רוצה ביטול מיזוג. מאדום, בר הופך לכחול. לחץ על "ביטול מיזוג" שוב על הלחצן כדי לקבל את השינויים.
7. אם אחד ניסיונות אניncorrectly למזג שתי פסגות במדגם אחד לתוך ערך KI אחת, הודעת שגיאה מודפס. בנסיבות כאלה, לבדוק מקרוב הכרומתוגרמה ולהגדיר מחדש את החלון KI באזור זה.
8. לאחר שכל פעולות המתמזגות בוצעו, לשמור את הקובץ.
9. לפני שתמשיך ניתוחים סטטיסטיים, chromatograms האוויר ואת החסר הבקבוקון מנותחים לפקח על זיהומים אפשריים. לאחר KI של פסגות את החסר זוהו, לחסר שטח של שיא זוהה אוויר ו / או בקבוקון אפס מאזור הנוכחי לשיא במדגם.
   להמשיך כך עם ניתוחים סטטיסטיים.

4. נציג תוצאות

האף האלקטרוני היה מסוגל לזהות הבדלים פרופילים נדיפים בקרב פירות שנקטפו מלון בשלבים שונים לפדיון (איור 5). עשרים KI חלונות זוהו לאורך כל הדגימות. ניתוח שונות הראה כי 14 פסגות detected על ידי האף האלקטרוני הבדל משמעותי בין שלבי הבגרות. באיור 6, יומן האזורים שיא ממוצע של 14 רכיבים אלה נרשמות להראות הבדלים שכיחותם שיא בין שני שלבים בשלות, בוגרות מוקדם פרי בשל לחלוטין.

באיור 1. דוגמאות של תבנית נתונים לייצא מתוך התוכנה במכשיר () ואחרי השינוי, שבוצעה באמצעות סקריפט "reform_data.py" (ב '). כדי להקל על נתונים מניפולציה וניתוח, כל כיס ייחודיים מזוהים בכל הדגימות, אז הנתונים הם מחדש בצורה מידע מדגם בשורות ושטח השיא בעמודות, המתאימים כיס ייחודיות. אם השיא לא זוהה על הערך KI במדגם, התא המתאים נשאר ריק.

2. איור לכידת מסך מ שטרלא קובץ "kim_interface.py". במרכז העלילה מציגה מספר כניסות לכל KI מול קי. "הכה לכל KI" הוא מספר דוגמאות שבהן שיא עם KI ספציפי זה היה שזוהו. בצד שמאל, יש שלוש קופסאות צהובות השליטה הנתונים שנבחרו. הם מציגים פרמטרים לחלק את ערכת נתונים (טיפולים, משכפל, משתנים איכותיים, וכו '). בנתון זה, הם (מלמעלה למטה):, וראייטי תאריך נטיעה הבמה לפדיון על הקציר. בתחתית: על ידי לחיצה על 3 ברים והעברה בר כחול שמאלה או ימינה, אפשר לבחור את מינימום הערך המרבי של הטווח קי, וחבל שיא המינימום ("סף"). מימין: כפתור "מיזוג" מאפשר מיזוג כיס נבחרים באופן ידני על ידי לחיצה על הסורגים בעלילה. כפתור "ביטול מיזוג" מאפשר להפוך את התהליך במקרים נבחרים.

3. איור כיסו על chromatograms (ב שחור ואדום) של 2 הטכני משכפל מ אמיץ את מלון תנודתי כדי להמחיש שינוי זמן השמירה.

איור 4. דוגמה KI מיזוג ההליך. בעלילה המרכזית, בר ירוק (מרכז KI) מייצג את KI המאוכלס ביותר, אשר נבחרה כמרכז של החלון קי. KI X ו-Y הם KI כיס נופלים בחלון עניין והם צריכים ימוזגו לתוך KI המרכזי. על ידי לחיצה ימנית בשורת KI של X, מסתבר אדום, בעת ובעונה אחת, בר כחול באורך זהה של בר KI של X, מופיע על גבי אחד ירוק. על ידי חזרה על אותו תהליך של KI-Y, את אורך הבר הכחול (KIS התמזגו) יגדל באורך המתאים. לאחר כל כיס נוספו, על ידי לחיצה על הכפתור הירוק "מיזוג", מסתיים תהליך מיזוג, השינויים יישמרו, וגם את צבע הכפתור הופך צהוב.

/ Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg "/>
איור 5. שני chromatograms של דגימות מלון שנקטפו בשלבים שונים לפדיון, בוגרת מוקדם (למעלה) ובשלים לחלוטין (למטה), כדי להמחיש את היכולת של האף האלקטרוני כדי לאתר הבדלים שכיחותם נדיפים.

איור 6. העלילה רדאר מראה את אזור השיא של 14 רכיבים הנמצאים שתי דגימות מלון בשני שלבים שונים לפדיון מוקדם, בוגרים בשלים לגמרי. אזורי שיא מדווחים בהיקף יומן לעזור לדמיין השוואה. המספרים בסוף כל קרן מייצג את מדדי Kovats המתאימים.

Discussion

אפים אלקטרוניים מייצגים שיטה מבטיחה להערכה, מהירה מטרת פרופילים ארומה של פירות או נדיפים עשירים ודוגמאות. עם זאת, עובר בזמן השמירה מהווים אתגר לזיהוי שיא עלול להוביל לפרשנות שגויה של הנתונים כאשר שני chromatograms לא מיושרים באופן מושלם. בדיקה ויזואלית של chromatograms עולה כי ההשתנות של הזמנים שמירה בין דגימות לעתים קרובות נגרמת השיא אותו להיות מתויג עם ערכים קי שונים מעט (כ ± 10). זה מתורגם למספר מוגזם של KIS ייחודיים שהתגלו. על מנת לנצל את העובדות כי (א) תרכובות שונות נמצאים בשלבים שונים לפדיון (ב) טכנית משכפל זהים בקירוב, שני תסריטים מבוססי מחשב ("kim_merge.py", אשר מכיל את השגרה לטיפול בנתונים סט, ו "kim_interface.py", אשר מספק ממשק המשתמש הגרפי (GUI)) פותחו באופן שיטתילהשוות דגימות באופן חצי אוטומטי, מאוד לצמצם את הזמן הדרוש לניתוח הכרומתוגרמה של ערכות נתונים גדולות. תוכניות אלה מאפשרות איחוד, מקום שמתאים, של פסגות שכותרתו עם מגוון של ערכים קי תחת המותג KI אחת. זו משרתת שתי מטרות חשובות: (א) היא מאפשרת ניתוח סטטיסטי לטיפול פסגות כגון משתנה אחד, ו (ב) מאפשר זיהוי שיא בהשוואה למערכות אחרות וערכים שפורסמו. התוצאות המוצגות כאן עולה כי דגימות מלון ניתן אפליה על בסיס בגרות פרופיל ארומה באמצעות מערכת zNose בשילוב עם זיהוי KI הולם. זה מייצג את הטכנולוגיה החדשה מבטיחה ניתוח של נדיפים שעלולים לשמש תוכניות בקרת איכות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
סידן כלוריד	MP ביו רפואית	195088
2-Methylbutyl isovalerate	SAFC עולמי	W350613	≥ 98%, טבעי, ה-FCC
מתנול	פישר סיינטיפיק	A411-4
צלוחית	Sigma / Supelco	SU860098
כובע	Sigma / Supelco	SU860101
המעבדה בלנדר	וארינג מעבדה המדע	7009G	2 מהירות המערבל, 1 - מיכל זכוכית ליטר
בקבוק	פישר סיינטיפיק	06-414-1C	פיירקס, 500 מ"ל, פוליפרופילן התוספת חותם
מחט	חיישן אלקטרונית טכנולוגיה	TLC101046	חור בצד luer
אלקאנים פתרון	חיישן אלקטרונית טכנולוגיה		C6-C14 אלקאנים פתרון מתנול
zNose	חיישן אלקטרונית טכנולוגיה	דגם 4500
DB-5-GC עמודה	חיישן אלקטרונית טכנולוגיה	SYS4500C5
MicroSense	חיישן אלקטרונית טכנולוגיה	גרסה 5.44.22
Python 2.6			זמין בחינם מקוון
"Reform_data.py" ו "kim_interface.py" סקריפטים			הזמינות כחומר משלים על יופיטר סקריפטים