Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarosegelelektroforese de meest effectieve manier te scheiden DNA fragmenten van variërende grootte van 100 bp tot 25 kb ^1. Agarose is geïsoleerd van het zeewier geslachten Gelidium en Gracilaria, en bestaat uit herhaalde agarobiose (L-en D-galactose) subeenheden ^2. Tijdens gelering, agarose polymeren niet-covalent geassocieerd en een netwerk vormen bundels die poriegrootten bepalen van een gel moleculaire zeven eigenschappen. Het gebruik van agarose gel elektroforese revolutie de scheiding van DNA. Voorafgaand aan de vaststelling van agarose gels, werd DNA in de eerste plaats gescheiden met behulp van sucrose dichtheidsgradiënt centrifugeren, die alleen voorzien in een aanpassing van de grootte. DNA met agarose gel elektroforese scheiden, wordt het DNA geladen prefab putjes in de gel en een stroom toegepast. De fosfaat ruggengraat van het DNA (en RNA) molecuul negatief geladen derhalve, wanneer geplaatst in een elektrisch veld wordt DNA fragmenten migreren naar de positively geladen anode. Omdat DNA heeft een massa / ladingsverhouding worden DNA-moleculen gescheiden op grootte op een agarose gel in een zodanig patroon dat de afstand afgelegd omgekeerd evenredig met de log van het molecuulgewicht ^3. De belangrijkste model DNA bewegen door een agarose gel wordt "voorgespannen reptation", waarbij de voorrand voren beweegt en trekt de rest van het molecuul aan ^4. De snelheid van migratie van een DNA molecule via een gel wordt bepaald door de volgende: 1) maat van DNA-molecuul; 2) agarose concentratie 3) DNA conformatie ^5, 4) toegepaste voltage, 5) de aanwezigheid van ethidiumbromide, 6) type agarose en 7) elektroforese buffer. Na de scheiding kan het DNA moleculen zichtbaar onder UV-licht na kleuring met een geschikte kleurstof. Door het volgen van dit protocol, moet de student in staat zijn om:

1. Begrijpen mechanisme waardoor DNA fragmenten worden gescheiden in een gelmatrix
2. Begrijpen hoe conformatie van deDNA-molecuul zal zijn bepalend voor de mobiliteit door middel van een gel matrix
3. Vaststellen van een agarose-oplossing van geschikte concentratie voor hun behoefte
4. Bereid een agarose gel elektroforese van DNA
5. Stel de gel elektroforese apparatuur en voeding
6. Kies een geschikte spanning voor de scheiding van DNA-fragmenten
7. Begrijp het mechanisme waarmee ethidiumbromide zorgt voor de visualisatie van DNA-banden
8. Bepaal de grootte van DNA fragmenten gescheiden