Électrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation de fragments d'ADN

Électrophorèse sur gel est le moyen le plus efficace de séparer des fragments d'ADN de différentes tailles allant de 100 pb à 25 kb ^1. Agarose est isolé de la génération d'algues Gelidium et Gracilaria, et se compose de agarobiose répétée (L et D-galactose) sous-unités ^2. Pendant la gélification, les polymères d'agarose associer de manière non covalente et forment un réseau de faisceaux dont les tailles des pores de déterminer une moléculaires gel de propriétés de tamisage. L'utilisation de gel d'agarose a révolutionné la séparation de l'ADN. Avant l'adoption des gels d'agarose, l'ADN a été principalement séparées par centrifugation sur gradient de saccharose de densité, qui ne donnent qu'une approximation de la taille. Pour séparer l'ADN en utilisant électrophorèse sur gel, l'ADN est chargé dans préfabriqués puits dans le gel et un courant appliqué. Le squelette phosphate de l'ADN (et ARN) molécule chargée négativement est, par conséquent, lorsqu'il est placé dans un champ électrique, des fragments d'ADN de migrer vers l'positively chargée d'anode. Fait que l'ADN a une uniforme rapport masse / charge, des molécules d'ADN sont séparés par la taille dans un gel d'agarose dans un motif de telle sorte que la distance parcourue est inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire ^3. Le modèle de premier plan pour un mouvement d'ADN à travers un gel d'agarose est "polarisée reptation", grâce à quoi le bord d'attaque se déplace vers l'avant et tire le reste de la molécule long ^4. Le taux de migration d'une molécule d'ADN dans un gel est déterminée par le suivant: 1) taille de molécule d'ADN; 2) la concentration d'agarose; conformation de l'ADN 3) ^5, 4) de tension appliquées, 5) la présence de bromure d'éthidium, 6) de type de tampon d'électrophorèse agarose et 7). Après la séparation, les molécules d'ADN peuvent être visualisés sous lumière UV après coloration avec un colorant approprié. En suivant ce protocole, les élèves devraient être en mesure de:

1. Comprendre le mécanisme par lequel des fragments d'ADN sont séparés au sein d'une matrice de gel
2. Comprendre comment la conformation de laMolécule d'ADN permettra de déterminer sa mobilité grâce à une matrice de gel
3. Identifier une solution d'agarose à la concentration appropriée à leurs besoins
4. Préparer un gel d'agarose pour l'électrophorèse d'échantillons d'ADN
5. Mettre en place l'appareil d'électrophorèse sur gel et l'alimentation
6. Sélectionner une tension appropriée pour la séparation de fragments d'ADN
7. Comprendre le mécanisme par lequel le bromure d'éthidium permet la visualisation des bandes d'ADN
8. Déterminez la taille de fragments d'ADN séparés