Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose-Gelelektrophorese ist der effektivste Weg zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe im Bereich von 100 bp bis 25 kb ^1. Agarose wird aus dem Seegras Gattungen Gelidium und Gracilaria isoliert und besteht aus wiederholten Agarobiose (L-und D-Galactose) Untereinheiten ^2. Während Gelierung, assoziieren Agarose-Polymere nicht-kovalent und bilden ein Netzwerk von Bündeln, deren Porengröße eines Gels bestimmen die Eigenschaften molekularer Siebung. Die Verwendung von Agarosegelelektrophorese revolutioniert die Trennung von DNA. Vor der Verabschiedung von Agarosegelen wurde die DNA in erster Linie getrennt mit Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, die nur unter der Voraussetzung eine Annäherung an Größe. Um die DNA unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese zu trennen, wird die DNA in vorgefertigten Vertiefungen in dem Gel und einem angelegten Strom geladen. Die Phosphat-Rückgrat der DNA (oder RNA) Molekül negativ geladen ist, damit, wenn sie in einem elektrischen Feld platziert wird, um DNA-Fragmente der p migrierenositively geladenen Anode. Da die DNA weist eine einheitliche Masse / Ladungs-Verhältnis, werden DNA-Moleküle nach Größe in einem Agarosegel in einem solchen Muster, dass die Strecke umgekehrt proportional zu dem Protokoll seiner Molekulargewicht ³ getrennt ist. Das führende Modell für die DNA-Bewegung durch ein Agarosegel ist, wobei die Vorderkante nach vorne bewegt und zieht den Rest des Moleküls entlang ⁴ "Reptation voreingenommen". ; 2) Agarose-Konzentration; 3) DNA-Konformation ^5; 4) angelegten Spannung, 5) Gegenwart von Ethidiumbromid, 6), Typ 1) Größe des DNA-Moleküls: Die Rate der Migration von einem DNA-Molekül durch ein Gel wird durch folgende Faktoren bestimmt Agarose und 7) Elektrophoresepuffer. Nach der Trennung können die DNA-Moleküle unter UV-Licht sichtbar gemacht nach dem Färben mit einem geeigneten Farbstoff. Durch Einhalten dieses Protokoll sollen die Studierenden in der Lage:

1. Verständnis des Mechanismus, durch den DNA-Fragmenten innerhalb einer Gelmatrix getrennt werden
2. Verstehen Sie, wie die Konformation desDNA-Molekül seine Mobilität durch einen Gel-Matrix zu bestimmen
3. Identifizieren Sie ein Agarose-Lösung geeigneter Konzentration für ihre Bedürfnisse
4. Bereiten Sie ein Agarosegel für die Elektrophorese von DNA-Proben
5. Richten Sie die Gelelektrophorese Apparate und Stromversorgung
6. Wählen einer geeigneten Spannung für die Trennung von DNA-Fragmenten
7. Verständnis des Mechanismus, durch den Ethidiumbromid ermöglicht die Visualisierung von DNA-Banden
8. Bestimmen Sie die Größen der aufgetrennten DNA-Fragmente