Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Elettroforesi su gel di agarosio è il modo più efficace per separare frammenti di DNA di dimensioni variabili da 100 bp a 25 kb ^1. Agarosio è isolato dalle alghe generi Gelidium e Gracilaria, e consiste di agarobiose ripetute (L-galattosio e D-) subunità ^2. Durante la gelificazione, polimeri agarosio associano in modo non covalente e formare una rete di fasci cui pori formati determinare proprietà molecolari setacciatura di un gel. L'uso di elettroforesi su gel di agarosio rivoluzionato la separazione del DNA. Prima dell'adozione di gel di agarosio, il DNA è stato principalmente separati impiegando densità centrifugazione gradiente di saccarosio, che ha fornito solo un'approssimazione di dimensioni. Per separare DNA usando elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene caricato in prefabbricati pozzetti nel gel e una corrente applicata. Lo scheletro di fosfato del DNA (e RNA) molecola è caricato negativamente, quindi quando posti in un campo elettrico, frammenti di DNA migrerà al positively carica anodo. Poiché il DNA ha una massa uniforme / carica rapporto, molecole di DNA vengono separati da una dimensione in un gel di agarosio in uno schema tale che la distanza percorsa è inversamente proporzionale al log del suo peso molecolare ^3. Il modello importante per il movimento DNA attraverso un gel di agarosio è "polarizzato reptation", per cui il bordo si muove in avanti e tira il resto della molecola lungo ^4. La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel è determinata dalla seguente: 1) dimensione della molecola di DNA; 2) concentrazione di agarosio; 3) DNA conformazione ^5; 4) tensione applicata, 5) presenza di bromuro di etidio, 6) Tipo di agarosio e 7) tampone di elettroforesi. Dopo la separazione, le molecole di DNA possono essere visualizzati sotto luce UV dopo colorazione con un colorante appropriato. Seguendo questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di:

1. Comprendere il meccanismo mediante il quale vengono separati frammenti di DNA all'interno di una matrice gel
2. Capire come conformazione delMolecola di DNA a determinare la sua mobilità attraverso una matrice di gel
3. Identificare una soluzione di agarosio di concentrazione adeguato alle loro esigenze
4. Preparare un gel di agarosio per elettroforesi su campioni di DNA
5. Sistemare il dispositivo di elettroforesi su gel e alimentazione
6. Selezionare una tensione appropriata per la separazione di frammenti di DNA
7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale permette di bromuro di etidio per la visualizzazione delle bande di DNA
8. Determinare le dimensioni dei frammenti di DNA separati