Agarose gelelektroforese for separasjon av DNA-fragmenter

Agarose gel elektroforese er den mest effektive måten å skille DNA-fragmenter av varierende størrelser fra 100 bp til 25 kb ^1. Agarose er isolert fra tang slektene Gelidium og Gracilaria, og består av gjentatte agarobiose (L-og D-galaktose) subenheter ^2. Under gelation, agarose polymerer knytte ikke-kovalent og danne et nettverk av bunter som porestørrelser fastslå en gel er molekylære sikting egenskaper. Bruken av agarose gel elektroforese revolusjonert separasjon av DNA. Før vedtakelsen av agarose gels, ble DNA primært skilt ved sukrose tettshetsgradient sentrifugering, som bare ga en tilnærming av størrelse. For å skille DNA ved hjelp av agarose gel elektroforese, er DNA lastet inn pre-cast brønner i gel og en gjeldende anvendt. Den fosfat ryggraden i DNA (og RNA)-molekylet er negativt ladet, derfor når den plasseres i et elektrisk felt, vil DNA-fragmentene vandrer til positively ladet anode. Fordi DNA har en jevn masse / belaste forholdet, er DNA-molekyler skilles etter størrelse innenfor en agarose gel i et mønster slik at avstanden er omvendt proporsjonal til loggen sin molekylvekt ^tre. Den ledende modellen for DNA bevegelse gjennom en agarose gel er "forutinntatt reptation", der ledende beveger seg frem og trekker resten av molekylet langs ^fire. Satsen for migrering av et DNA-molekyl gjennom en gel bestemmes av følgende: 1) Størrelsen på DNA-molekylet, 2) agarose konsentrasjon, 3) DNA konformasjon ^5, 4) spenning, 5) tilstedeværelse av etidiumbromid, 6) skriver av agarose og 7) elektroforese buffer. Etter separasjon, kan DNA-molekyler bli visualisert under UV lys etter farging med en passende farge. Ved å følge denne protokollen, skal studentene kunne:

1. Forstå mekanismen som DNA-fragmentene er separert i en gel matrise
2. Forstå hvordan konformasjon avDNA-molekylet vil avgjøre sin mobilitet gjennom en gel matrise
3. Identifisere en agarose løsning av passende konsentrasjon for deres behov
4. Forbered en agarose gel for elektroforese av DNA-prøver
5. Sett opp gelelektroforese apparater og strømforsyning
6. Velg en passende spenning for separasjon av DNA fragmenter
7. Forstå mekanismen som etidiumbromid tillater visualisering av DNA band
8. Bestem størrelsen på skilt DNA fragmenter