Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

La agarosa electroforesis en gel es la forma más eficaz de separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños que van desde 100 pb a 25 kb ^1. La agarosa es aislado a partir de las algas géneros Gelidium y Gracilaria, y consta de agarobiose repetida (L y D-galactosa) subunidades ^2. Durante la gelificación, los polímeros de agarosa asociación no covalente y formar una red de paquetes cuyo tamaño de poro determinar un gel de propiedades moleculares de tamizado. El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionado la separación del ADN. Antes de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separó utilizando principalmente de densidad de sacarosa centrifugación en gradiente, que sólo proporcionan una aproximación de tamaño. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de fosfato del ADN (y ARN) molécula está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán a la positively cargo del ánodo. Debido a que el ADN tiene un uniforme relación masa / carga, las moléculas de ADN se separan por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular ^3. El modelo principal para el movimiento de ADN a través de un gel de agarosa es "parcial reptación", con lo que el borde delantero se mueve hacia adelante y tira el resto de la molécula a lo largo de ^4. La velocidad de migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por el siguiente: 1) el tamaño de la molécula de ADN, 2) la concentración de agarosa; 3) conformación de ADN ^5, 4) la tensión aplicada, 5) presencia de bromuro de etidio, 6) de tipo de tampón de electroforesis en agarosa y 7). Después de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV después de la tinción con un colorante adecuado. Siguiendo este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de:

1. Comprende el mecanismo por el cual los fragmentos de ADN se separan dentro de una matriz de gel
2. Comprender cómo la conformación de laMolécula de ADN determinará su movilidad a través de una matriz de gel
3. Identificar una solución de agarosa de la concentración adecuada a sus necesidades
4. Preparar un gel de agarosa para electroforesis de las muestras de ADN
5. La instalación del equipo de electroforesis en gel y la fuente de alimentación
6. Seleccionar un voltaje apropiado para la separación de fragmentos de ADN
7. Comprende el mecanismo por el cual el bromuro de etidio permite la visualización de las bandas de ADN
8. Determinar los tamaños de los fragmentos de ADN separados