Agarosgelelektroföres för separation av DNA-fragment

Agarosgelelektrofores är det mest effektiva sättet att separera DNA-fragment av varierande storlek som sträcker sig från 100 bp till 25 kb ^1. Agaros isoleras från tång släktena Gelidium och Gracilaria, och består av upprepade agarobiose (L-och D-galaktos) subenheter ^2. Under gelatinering, agaros polymerer associera icke-kovalent och bildar ett nätverk av buntar vars porstorlekar bestämma en gelens molekylsiktning egenskaper. Användning av agarosgelelektrofores revolutionerat separation av DNA. Innan antagandet av agarosgel, DNA främst separeras med sukros densitetsgradientcentrifugering, vilket bara gav en approximation av storlek. Att separera DNA med användning av agarosgel-elektrofores, är det DNA laddas in förtillverkade brunnar i gelén och en ström som påläggs. Fosfatryggraden i DNA (och RNA)-molekyl är negativt laddad, därför när den placeras i ett elektriskt fält, kommer DNA-fragment migrerar till positively laddade anoden. Eftersom DNA har en likformig massa / laddningsförhållande, är DNA-molekyler separeras med storlek inom ett agaros-gel i ett sådant mönster att det avstånd som tillryggalagts är omvänt proportionell mot logaritmen för molekylvikten ^3. Den ledande modell för DNA-rörelsen genom en agaros-gel "förspänd reptation", varvid den främre kanten rör sig framåt och drar resten av molekylen längs ^4. Graden av migration av en DNA-molekyl genom en gel bestäms av följande: 1) storleken på DNA-molekylen, 2) agaros koncentration, 3) DNA konformation ^5, 4) spänning, 5) Förekomsten av etidiumbromid, 6) typ av agaros och 7) elektroforesbuffert. Efter separation kan DNA-molekylerna vara visualiserades under UV-ljus efter färgning med ett lämpligt färgämne. Genom att följa detta protokoll ska studenten kunna:

1. Förstå den mekanism med vilken DNA-fragmenten separeras i en gelmatris
2. Förstå hur konformationen avDNA-molekylen avgör dess rörlighet genom en gelmatris
3. Identifiera en agaros-lösning med lämplig koncentration för deras behov
4. Framställa en agarosgel för elektrofores av DNA-prover
5. Sätt upp utrustningen gelelektrofores och strömförsörjning
6. Välja en lämplig spänning för separation av DNA-fragment
7. Förstå den mekanism med vilken etidiumbromid medger visualisering av DNA-band
8. Bestäm storleken på separerade DNA-fragment