التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Summary

توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.

Abstract

في electroporation الرحم (IUE) أصبحت تقنية قوية لدراسة تطوير مناطق مختلفة من الجهاز العصبي الجنيني ^1-5. ولم يتم حتى الآن هذه الأداة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تنظيم الانتشار الخلوي، والتمايز وهجرة الخلايا العصبية وخصوصا في القشرة الدماغية النامية ^6-8. هنا نحن لدينا تفاصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين، وتقديم الأدلة التي يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.

وقد ساهمت التصور والتلاعب في الخلايا العصبية في الثقافات الأولية إلى فهم أفضل للعمليات المشتركة في التغصنات، العمود الفقري والتنمية المشبك. ومع ذلك لا تتعرض الخلايا العصبية المتزايدة في المختبر إلى العظة جميع الفسيولوجية التي يمكن أن تؤثر التغصنات و / أو تشكيل العمود الفقري والصيانة خلال التطور الطبيعي. معرفتنا للهياكل التغصنات والعمود الفقري 9. ومع ذلك، يعتبر جولجي تلطيخ لتكون غير متوقعة. في الواقع، وصفت مجموعة من الخلايا العصبية ومساحات الألياف عشوائيا، مع مناطق معينة تظهر في كثير من الأحيان الملون تماما بينما المناطق المتاخمة خالية من تلطيخ. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن IUE من بنيات فلوري يمثل طريقة جذابة بديل لدراسة التشعبات، العمود الفقري، فضلا عن نقاط الاشتباك العصبي في فئرانا معدلة وراثيا / البرية من نوع ^10-11 (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك بالمقارنة مع جيل من الماوس بالضربة القاضية، IUE يمثل نهجا السريع لأداء الربح والخسارة من وظيفة في دراسات سكانية محددة من الخلايا خلال نافذة زمنية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم IUE استخدمت بنجاح مع التعبير الجيني محرض أو محرض رني تقترب لتحسين السيطرة الزمنية على التعبير عن الجينات أو shRNA ^12. هذه المزايا من IUE وبالتالي openeد أبعادا جديدة لدراسة تأثير في التعبير الجيني / قمع في التشعبات والعمود الفقري، ليس فقط في هياكل محددة الدماغي (1B الشكل)، ولكن أيضا في نقطة زمنية محددة للتنمية (الشكل 1C).

أخيرا، IUE يوفر أداة مفيدة لتحديد تفاعلات وظيفية بين الجينات المسؤولة عن التغصنات، العمود الفقري و / أو تطوير المشبك. في الواقع، خلافا لغيرها من وسائل نقل الجينات مثل الفيروس، وذلك واضح ومباشر على الجمع بين رني متعددة أو الجينات المحورة في نفس السكان من الخلايا.

وخلاصة القول، IUE هو وسيلة قوية التي سبق أن ساهمت في توصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة الدماغ والمرض، وأنه ينبغي أن يكون مفيدا أيضا في دراسة التشعبات والعمود الفقري.

Protocol

في المملكة المتحدة، ويعيش الفئران، ولدت، وتعامل وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها وزارة الداخلية تحت الحيوان (إجراءات علمية) لعام 1986.

1. إعداد: الحل الحمض النووي وإبر

1. تنقية البلازميد مع عدة الذيفان الداخلي ماكسي الإعدادية الحرة. إعداد البلازميد حل للحقن الحمض النووي المطلوب لتركيزات في الماء وإضافة الأخضر السريع (تركيز النهائي من 0.05٪) لتصور عن طريق الحقن. كفاءة electroporation تعتمد بشكل كبير على تركيز الحمض النووي. يستخدم عادة للتركيز من 1 ميكروغرام / ميكروليتر. هذا التركيز غير كاف لتصور الخلايا العصبية electroporated دون التأثير على تنميتها. ومع ذلك، وفقا لالمروج المستخدمة في ناقلات البلازميد (الأقل مستوى التعبير مع المروج المضخم للخلايا / محسن، قوي مستوى التعبير مع محسن المضخم للخلايا في وقت مبكر فوري والدجاج الانصهار المروج β-الأكتين (CAG) المروج)، فضلا عن حجم و استقرار من البروتين وأعرب، ويمكن تعديل هذا التركيز (0.25 ميكروغرام / ميكروليتر إلى 5 ميكروغرام / ميكرولتر).
2. سحب الإبر الزجاج باستخدام مجتذب micropipette.

2. التحضير للجراحة

1. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية والفوسفات المالحة العازلة (PBS).
2. يعد حل مسكن في برنامج تلفزيوني (البوبرينورفين، Vetergesic، تركيز النهائي 30 ميكروغرام / مل). وزن الماوس الحوامل وحقن تحت الجلد 0.1 ملغ / كلغ من Vetergesic 30 دقيقة على الأقل قبل الجراحة. خلال هذا الوقت، واعداد منطقة الجراحية. بدوره على منصات التدفئة وغرفة الإنعاش. وضع برنامج تلفزيوني العقيمة في حمام ماء دافئ وجميع الأدوات والمواد المعقمة على الستائر العقيمة. وضع أقطاب البلاتين في كأس مملوءة PBS والاتصال electroporator. شغل الإبرة مع الحل القائم على الحمض النووي باستخدام طرف microloader، ربط الإبرة لصاحب الشعرية وقرصة قبالة رأس الإبرة مع الملقط.

e_title "> 3. جراحة قبل حقن الحمض النووي وElectroporation

1. تخدير ماوس الحوامل (E14.5-E15.5) مع isoflurane في الناقل الأكسجين (الأوكسجين 2 لتر / دقيقة) باستخدام غرفة الاستقراء مخدر. الانتظار حتى يفقد الحيوان والمنعكس التقويمي.
2. نقل الحيوان إلى قناع "ما قبل عملية جراحية". ضع قطرة من هلام العين على كل عين لمنع تقرح القرنية في العين في حين كانت الأم تحت التخدير العام. استخدام الحلاقة الكهربائية لحلاقة الشعر من البطن. تنظيف المنطقة حليق مرة واحدة مع clorhexidine لجمع شعر الطيران.
3. نقل الحيوان إلى قناع الثاني في مجال الجراحة. ضع الماوس مع ظهرها للسادة التدفئة. بدء عملية جراحية عندما تم فقدان المنعكس دواسة.
4. وضع على قناع وقفازات معقمة. تغطية حيوان مع ثنى معقم (مع وجود ثقب صغير فوق البطن) لمنع الأنسجة والأدوات من التلوث من المناطق من الجلد التي لم يتم حلق وتطهيرها. تنظيف المنطقة حليق 1تي لا يقل عن 3 مرات مع clorhexidine. استخدام مختلف مسحة القطن المعقم في كل مرة. استخدام مشرط لجعل شق عمودي على طول خط الوسط (~ 1 بوصة طويلة) من خلال الجلد. باستخدام مقص، وجعل شق مماثل للعضلات البطن على طول الخط ألبا (الخط الأبيض تتألف في معظمها من النسيج الضام الكولاجين).
5. اختيار الأجنة التي يمكن الوصول إليها ووضع ملقط خاتم بين اثنين من الأجنة وسحب بعناية سلسلة الجنينية من تجويف البطن. من هذه النقطة، والحفاظ على الأجنة رطب مع برنامج تلفزيوني قبل حرارة العقيمة.

لم يكن يحتاج إلى مجهر لتصور.

4. حقن الحمض النووي وElectroporation

1. تبدأ مع واحدة من أجنة معظم الأطراف، مما يجعل من الاسهل لتتبع التي تم electroporated الأجنة. لا تسحب أكثر من اللازم على الأجنة حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة خطر النزف. التلاعب في موقف للجنين داخل الكيس الذي يحيط بالجنين باستخدام ملقط وخاتماستقرار رئيس الأجنة بين الحلقات. الضغط بلطف لدفع ما يصل الجنين أقرب إلى جدار الرحم.
2. مع من ناحية أخرى، أخذ صاحب الشعرية ويدخل الإبرة بعناية في وسط الكرة الأرضية لاستهداف بطين الوحشي. اضغط على دواسة لحقن ما يقرب من 1 ميكرولتر من الحمض النووي حل سريع مختلطة مع الأخضر (ميكرولتر أقل من 1 في دراسة التشعبات). يجب الانتباه الصبغة الخضراء ملء البطين الجانبي. الخطوات الحاسمة: - وحدة من الإبرة أمر بالغ الأهمية لاختراق جدار الرحم بشكل صحيح. من المهم للحد من حركة إبرة على سطح جدار الرحم وبعد الإدراج إلى البطين لأن توسيع الثقب سيؤدي إلى تسرب السائل الذي يحيط بالجنين وفاة الجنين. تجنب الأوعية الدموية ثقب في جدار الرحم، وهذا سوف يؤدي إلى النزيف والموت جنين.
   - من المهم عدم ضخ كمية كبيرة جدا من الحمض النووي إلى البطين الجانبي لأنها من شأنها أن تحفزموه الرأس (لا تتجاوز 2 في E14.5 ميكرولتر). يتم ضبط حجم من الحمض النووي وفقا للغرض من هذه التجربة. إذا تم استخدام 1μl عموما بالنسبة لمعظم التجارب، لا بد من أصغر حجم من الحمض النووي (حوالي 0.5 ميكرو لتر) لالتغصنات وتحليل العمود الفقري. في الواقع بضع خلايا معزولة بحاجة إلى أن توجه من أجل تصور وقياس شجرة الجذعية من الخلايا العصبية electroporated.
3. وضع أقطاب كهربائية على جانبي الرأس الجنين مع مجداف (+) ايجابية على الجانب نفس البطين حقن لelectroporation قشرة أو على الجانب الآخر من البطين حقن لelectroporation الحصين (الشكل 2). ثم تطبيق 5 النبضات الكهربائية 30V (50 ميللي ثانية مدتها) على فترات ثانية 1. خطوة حاسمة: تجنب تطبيق الحالي عبر المشيمة وهذا سوف يؤدي إلى وفاة الجنين.
   ويمكن electroporated جميع الأجنة في ماوس الحوامل، وعادة مع نفس الحمض النووي بناء على تجنب أي التباس. ومع ذلك، فإن انخفاض عملية جراحية طويلة ق معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة. لا ينبغي أن تجويف البطن يمكن فتح أكثر من 30 دقيقة.

5. عملية جراحية في مرحلة ما بعد electroporation

1. بعد electroporating الأجنة، إضافة إلى برنامج تلفزيوني تجويف البطن واستخدام الملقط حلقة ليحل محل قرن الرحم في موقعه الأصلي. خياطة جدار البطن والجلد مع الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص Vicryl.
2. وضع الحيوان في غرفة الإنعاش حتى يستيقظ (5-10 دقيقة عادة)، ثم نقل في قفص وضعها على وسادة التدفئة.

6. بعد الجراحة

تحقق سلوك الفئران لتقييم الألم والمعاناة أو الشدة وتزن هذه الحيوانات 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة. إذا لزم الأمر، يمكن أن تدار المسكنات للتقليل من الألم والانزعاج.

7. معالجة الأنسجة

جمع الأجنة electroporated أو الصغار في المراحل الجنينية أو بعد الولادة المطلوبة للتجربة.

ove_content "> - بالنسبة للتحليل في المراحل الجنينية (على سبيل المثال لدراسة تكاثر الخلايا أو هجرة):
أم الموت ببطء عبر التفكك عنق الرحم وجمع الأجنة. بعد قطع الرأس، وحدد العقول التي تم electroporated بشكل صحيح، وتصور كما يدل على ذلك حجم وموقع للإشارة فلوري، عبر الجمجمة باستخدام مجهر نيون. تشريح الدماغ من الجمجمة وإصلاح بين عشية وضحاها في PFA 4٪ وبعد ذلك في مكان السكروز 20٪ / في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تغرس في مجمع أكتوبر، وتجميد في -80 درجة مئوية، والباب باستخدام ناظم البرد.

- بالنسبة للتحليل في مراحل ما بعد الولادة (على سبيل المثال لدراسة التشعبات والعمود الفقري):
الجراء أو تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتون (40-60 ملغ / كلغ)، وتأدية نضح transcardial مع برنامج تلفزيوني، تليها PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني. تشريح أدمغة من الجمجمة وآخر في الإصلاح بين عشية وضحاها PFA 4٪. بعد الغسيل في برنامج تلفزيوني، قسم أدمغة باستخدام vibratome (100 ميكرون للقطاعات دendrite تحليل). تحميل المقاطع في بولي أكوا / جبل باستخدام coverslips مم 0،16-0،19 سميكة إلى التشعبات صورة والعمود الفقري.

8. ممثل النتائج

ويبين الشكل 3 أمثلة على الخلايا electroporated في قشرة الدماغ (أرقام 3A، B)، في CA1 (أرقام 3C، D) وكذلك في التلفيف المسنن لقرن آمون (أرقام 3E، F). وelectroporated البرية من نوع الفئران في E14.5 مع تأنشا GFP (PCA-B-EGFPm5 كاتم الصوت 3) والعقول كانت تحصد في يوم ما بعد الولادة (P) 14. عن طريق حقن كمية صغيرة من محلول الحمض النووي (0.5 ميكرو لتر أو أقل من التوصل إلى حل في 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، وصفت بضع خلايا، والذي يسمح التصور من تشجر شجيري من عزل خلايا + GFP (الشكل 3) وكذلك العمود الفقري لها في أعلى التكبير (الشكل 4).

<قوي> الشكل 1. تمثيل تخطيطي من البروتوكولات electroporation التي يمكن استخدامها لدراسة التشعبات والعمود الفقري. (A) Electroporation من GFP بناء على مقارنة التشعبات والعمود الفقري في الفئران البرية من نوع ومتحولة. (ب) من Electroporation GFP-shRNA (يتم التعبير عن GFP من التصور نفسه) لمقارنة التشعبات والعمود الفقري في الفئران electroporated مع shRNA بناء محددة لجينة من مصلحة (X) أو shRNA السيطرة. (ج) يمكن أن تستخدم IUE جنبا إلى جنب مع نظام محرض لجنة المساواة العرقية من أجل تقييد التعبير عن shRNA إلى الفترة الزمنية مرغوب فيه. في هذه التجربة، ناقل تعبر عن شكل من recombinase لجنة المساواة العرقية التي يمكن تفعيلها من خلال hydroxytamoxifen-4 (CAG ^ER-T2 CreER ^T2؛ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) وelectroporated ^10، جنبا إلى جنب مع ناقلات تعبر عن shRNA معين في لجنة المساواة العرقية التي تعتمد الطريقة (1 ميكروغرام / ميكروليتر، مع وجود مؤشر إعادة التركيب (CALNL-GFP بناء، GFP محرض التعبير بواسطة لجنة المساواة العرقية؛. 1 ميكروغرام / ميكرولتر) ¹⁰ وكفاءهويمكن تحسين قبرصي لضربة قاضية من خلال زيادة تركيز shRNA فضلا عن زيادة المساعدة النقدية-ER ^T2 تركيز ^T2 CreER.

الشكل 2. السيطرة المكانية من electroporation. هذا الرقم يظهر فيها لوضع أقطاب كهربائية مجداف وفقا لموقع حقن الحمض النووي من أجل استهداف قشرة الدماغ أو في قرن آمون.

الشكل 3. electroporated التصور من شجرة شجيري من داخل الرحم الخلايا في قشرة الدماغ والحصين. (A، B) أقسام الاكليل تظهر GFP + الخلايا الهرمية في قشرة الدماغ، (CD) في الخلايا الهرمية CA1 من الحصين و(E، F)، الخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في P14. وكان electroporated تأنشا GFP (PCA-B-EGFPm5 كاتم الصوت 3) في E14.5. صور تضخم أعلى (B، D، F) تبين أن IUE وسيلة فعالة لتصور التشعبات. الحانات النطاق تمثل 50 ميكرومتر (B، D و F)، و 150 ميكرون (A، C، E).

الشكل 4. التصور من العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في P14 التي تم electroporated في الرحم في E14.5 مع GFP معربا عن بناء. (A، B) وصور عالية التكبير من العمود الفقري من التشعبات القاعدية من الخلايا العصبية الهرمية قرن آمون. الحانات النطاق تمثل 5 ميكرون (أ) و 2 ميكرومتر (B).

Discussion

IUE هو أداة قوية لمعالجة الجينات، ليس فقط في الفضاء ولكن أيضا في الوقت المناسب. نعرض هنا يمكن أن تستخدم هذه التقنية لتصور والتلاعب وراثيا التشعبات والعمود الفقري في قشرة الدماغ والحصين من الفئران. بالإضافة إلى المزايا المذكورة سابقا، ومن الجدير بالذكر أن IUE، على النقيض من غولجي الأسلوب، يمكن دمجها مع المناعية أو في التهجين في الموقع، والذي يسمح على سبيل المثال إلى النمط الظاهري للخلايا electroporated. من المهم أيضا أن نذكر أن هذا الإجراء لا يسبب تشوهات في المخ واضح على الرغم من الغازية النسبي. وبالإضافة إلى ذلك، على المستوى الخلوي، IUE لا تعديل خصائص الكهربية للخلايا العصبية electroporated ^13. في حين يركز على مظاهرة لدينا تصور morphologies التغصنات والعمود الفقري، يمكن أيضا IUE من العصبونات القشرية أو قرن آمون في E14.5 أن تستخدم لدراسة أحداث التنموية الأخرى مثل تشكيل محور عصبي والتوجيه. في إضافةويمكن تنفيذ ition، نفس النوع من بروتوكول في مراحل أخرى من التطور الجنيني لاستهداف مجموعات سكانية مختلفة. على سبيل المثال، يمكن تنفيذ نموذجا تنمويا electroporation جدا القشرية في وقت متأخر من E18.5 لدفع التعبير في الأسلاف نجمي ^1. وبالمثل، في حين أن electroporation من قرن آمون في E14.5 يسمح لاستهداف CA1-CA3 أسلاف الخلايا العصبية الهرمية والمسنن السلف الخلية الحبيبية في الوقت نفسه، فإن electroporation أواخر قرن آمون (E18.5 أو بعد الولادة في وقت مبكر) تسمح لاستهداف حبيبة المسنن مختلفة الأسلاف ^14. في هذه الحالة، يمكن زيادة حجم حقن الحمض النووي، فضلا عن شدة التيار.

الجينات المحورة التي أدخلها IUE يبدو أن تظل episomal وخسر بالتالي من الخلايا بعد الانقسامات الخلوية المتتالية. في الخلايا تالية للتفتل مثل الخلايا العصبية، ومع ذلك، فإن الجينات المحورة episomal تبقى نشطة لعدة اشهر بعد electroporation السماح للدراسات طويلة الأجل ¹³، 15. في دراستنا، لاحظنا GFP مشرق ⁺ الخلايا تصل إلى 7 أسابيع بعد الولادة (نقطة آخر مرة قمنا بتحليل) تشير إلى أن الجنينية استهداف السلائف العصبية القشرية أو قرن آمون استخدام نتائج IUE في التعبير المستمر للالتحوير في وقت مبكر من نقاط حتى وقت التنموية إلى سن البلوغ.

وجود قيود الحالي للتقنية هو أنه من الصعب ممارسة دفع غرامة السيطرة على العدد الكلي للخلايا electroporated. ومع ذلك، من خلال خفض حجم حقن محلول الحمض النووي، وأظهرنا أنه من الممكن ان تصف خلايا قليلة، وعلى تصور تشجر شجيري من خلايا منعزلة + GFP وكذلك العمود الفقري لها. ويمكن أيضا البعد عن منطقة transfected يمكن تعديلها عن طريق تعديل المعلمات من electroporation مثل شدة التيار وعدد من البقول أو القطر من المجاذيف electroporation.

تماما IUE هو طريقة التي هي سهلة لتنفيذ وسريعة وفعالة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في الجسم الحي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
			إعداد الإبر وحل الحمض النووي للحقن
Endofree كيت ماكسي البلازميد	QIAGEN	12362
سريع الأخضر	سيغما	F-7258
البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية 1.0 مم OD X 0،58 ملم معرف	هارفارد جهاز	30-0016
Microloader نصائح	إيبندورف	5242956003	لإيبندورف الماصات 0،5 ميكروليتر-10 ميكروليتر / ميكرولتر 2-20
		& Nباهوجان ساماج؛	المواد اللازمة لعملية جراحية
خارج رقيقة مقص ايريس	أدوات العلم غرامة	14088-10
منحني الملقط	أدوات العلم غرامة	91197-00
حلقة ملقط	أدوات العلم غرامة	11103-09
إبرة حامل	أدوات العلم غرامة	12002-12
غريف الملقط	أدوات العلم غرامة	11050-10
خيط ممتص Vicryl	Ethicon شركة (جونسون آند جونسون)	W9074
معقم الستائر 30cm × 45 سم	المغفل	141765
معقم مسحات	Shermond	HUBY-340
براعم القطن	نظيفة الصليب المحدودة	1860
البوبرينورفين (Vetergesic)	Alstoe صحة الحيوان
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
Viscotears العين هلام	شركة نوفارتيس
Isoflurane	مختبرات أبوت	B506
Pentoject، بنتوباربيتون الصوديوم 20٪	Animalcare
			Electroporation
Electroporator	BTX	ECM830
البلاتين Tweezertrod5mm ه	BTX، هارفارد جهاز	45-0489
Femtojet microinjector	إيبندورف	5247000030
قدم التحكم لMicroinjector Femtojet	إيبندورف	5247623002
الشعرية حامل	إيبندورف	5176190002
			معالجة الأنسجة
بارافورمالدهيد	سيغما	P6148
سكر القصب	VWR (Prolabo)	27480.294
مجهر الشرائح	ThermoScientific (منزل، جلاسر)	J1800AMNZ
Coverslips	منزل، جلاسر		22 × 50 مم # 1،5
أكوا بولي / جبل	Polysciences، وشركة	18606