可视化和遗传操作在小鼠大脑皮层和使用海马树突和棘<em&gt;在子宫内</em&gt;电穿孔

Summary

本文详细介绍了协议，在宫内electroporate大脑皮层和海马小鼠E14.5。我们还表明，这是一个有价值的方法来研究在这两个脑区的树突和刺。

Abstract

（IUE）为何在子宫内电已成为一个强大的技术来研究胚胎神经系统^1-5不同地区的发展。迄今为止，这个工具已经被广泛用于研究调控细胞增殖，分化和神经细胞迁移，尤其是在发展中国家大脑皮层^6-8。这里我们详细协议electroporate在子宫内的大脑皮质和海马和提供的证据表明，这种方法可以用来研究这两个脑区的树突和棘。

在原代培养神经元的可视化和操纵，有助于更好地理解到参与在树突棘和突触发展的进程。然而神经细胞在体外生长，没有接触到所有的生理线索，期间可能会影响正常发育枝和/或脊柱的形成和维护。我们的知识枝和脊柱结构9。然而，高尔基染色被认为是不可预测的。事实上，神经细胞和神经纤维束组随机标记，与特定领域经常出现的完全染色，而相邻的地区是没有染色。最近的研究表明，荧光结构IUE位置代表一个有吸引力的替代方法研究^10-11（ 图1A）突变型/野生型小鼠树突棘，以及作为突触。此外，相比一代鼠标击倒，IUE位置代表一个快速的方法进行细胞的特定人群在特定时间窗口增益和丧失功能的研究。此外，IUE位置已被成功地用于诱导基因表达或诱导的RNAi方法提炼的时间控制在表达一个基因或shRNA ^12。 ，IUE这些优势，从而opened个新的尺寸，研究基因表达/抑制不仅在特定的脑结构（ 图1B），但还处于发展的特定时间点（ 图1C）对树突棘的影响。

最后，IUE位置提供了一个有用的工具，以确定枝，脊椎和/或突触发育有关的基因之间的功能互动。事实上，在其他如病毒基因转移方法相比，它是直接结合多个RNA干扰或转基因细胞的相同人口。

总之，IUE位置是一个功能强大的方法，已经促成表征的脑功能和疾病背后的分子机制，也应该在树突棘的研究有用。

Protocol

在英国，老鼠被安置，繁殖，根据民政厅批准的指引下，动物（科学规程）行动1986年和治疗。

1。制备方法：DNA溶液和针头

1. 马克西准备套件内毒素纯化质粒DNA。准备质粒DNA溶液注射到所需的浓度在水中，加快绿（终浓度为0.05％），可视化注射。电效率是高度依赖的DNA浓度。一般使用的浓度为1μg/μL。这个浓度是足够的可视化，而不会影响其发展的电穿孔神经元。然而，根据质粒载体使用的启动以及大小和（低表达水平与巨细胞病毒启动子/增强，较强的表达水平与巨细胞病毒立即早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子融合（CAG）启动）表达蛋白的稳定性，这个浓度可以调整（0.25微克/微升至5微克/微升）。
2. 拉使用微量拔的玻璃针。

2。手术的制备

1. 高压灭菌的手术器械和磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 准备在PBS（丁丙诺啡，Vetergesic的，终浓度为30微克/毫升）的镇痛解决方案。称重孕鼠注射手术前至少30分钟皮下注射0.1毫克/千克Vetergesic。在这段时间内，准备手术区。打开电热垫和恢复室。温水澡和无菌单上所有无菌文书和材料放置在无菌PBS。一个PBS填充烧杯放入铂电极和连接的electroporator。使用microloader尖端的DNA解决方案填补针，针连接毛细管人，和一个镊子掐针尖。

e_title“> 3。手术前DNA注射和电

1. 怀孕鼠标（E14.5-E15.5）麻醉与异氟醚氧载体中使用的麻醉诱导室（氧气2升/分钟）。等到失去翻正反射的动物。
2. 动物转移到了“手术前”面具。每只眼睛上，以防止眼睛的角膜溃疡，而她的母亲是在全身麻醉下放置一个眼胶下降。使用电动剃须刀剃腹部的头发。清洁光头面积一次与clorhexidine收集飞行的头发。
3. 转移动物在手术区的第二个面具。鼠标将其加热垫的背面。开始时，踏板的反射已经失去手术。
4. 戴上口罩和无菌手套。覆盖无菌悬垂（用在腹部的小孔），以防止被污染的皮肤没有被剃光和消毒领域的组织和文书的动物。清洁光头区ţ至少与clorhexidine 3倍。每次使用不同的无菌棉签。使用手术刀，通过皮肤垂直切口，沿中线（1英寸长）。用剪刀沿白线（白线主要组成胶原蛋白的结缔组织），使类似的腹部肌肉的切口。
5. 选择最方便的胚胎，并放置两个胚胎之间的环钳小心地拉出腹腔胚胎链。从这点上，用无菌预温PBS水合保持胚胎。

没有显微镜的可视化要求。

4。注射DNA和电

1. 最外侧​​的胚胎开始，使其更容易追踪，其中胚胎进行电穿孔。不要拉太多的胚胎，因为这会增加出血的危险。内的羊膜囊使用环钳和操纵胚胎的位置稳定环之间胚胎头。轻轻挤推胚胎在子宫壁。
2. 另一方面，采取毛细管持有人，并针对侧脑室半球的中间插入针仔细。按踏板注入约1μLDNA溶液混合，固绿（小于1μL研究树突）。你应该遵守的绿色染料，填补了侧脑室。关键步骤： - 锐利的针头刺破的关键正确的子宫壁。重要的是要尽量减少在子宫壁表面，入脑室后插入针的运动，因为孔的扩大将导致泄漏羊水和胚胎死亡。避免在子宫壁刺入血管，因为这会导致出血和胚胎死亡。
   - 重要的是不要过大音量的DNA注入侧脑室，因为它会诱发脑积水（不超过2μL在E14.5）。根据实验的目的，调整的DNA量。如果1μL一般用于大多数实验使用，体积小的DNA（约0.5μL）枝和脊椎分析的需要。事实上，一些孤立的细胞都需要进行有针对性的，以可视化和测量电脉冲神经元的树突状乔木。
3. 将胚胎头部两侧电极的正极（+）注射皮质电脑室或海马电注入脑室（ 图2）对面的同一侧的桨。然后申请在1秒的时间间隔电脉冲30V（持续时间为50毫秒）。关键的一步：避免应用电流通过胎盘，因为这将导致胚胎死亡。
   在孕鼠的胚胎可以被电通常具有相同的DNA，构建以避免任何混淆。然而，长期以来手术减少 S的胚胎成活率。腹腔不应超过30分钟打开不再。

5。手术后的电

1. 电穿孔的胚胎后，加入腹腔PBS及使用环钳，子宫角，以取代原来的位置。 Vicryl可吸收缝合线缝合腹壁及皮肤。
2. 将在恢复室中的动物，直到它唤醒（通常5-10分钟），然后转移在笼子放置在加热垫。

6。手术后

检查小鼠的行为，以评估疼痛，​​痛苦或困扰，体重在手术后24小时和48小时的动物。如果需要，止痛药，可管理，以减少疼痛和不适。

7。组织处理

实验所需的胚胎或产后阶段收集的电穿孔胚胎或幼崽。

ove_content“ - 在萌芽阶段（例如，研究细胞增殖或迁移）分析：
安乐死的母亲通过颈椎脱位，收集胚胎。斩首后，选择已妥善电穿孔的大脑，通过荧光信号的数量和位置，可视化整个使用荧光双眼的头骨。解剖的头骨和大脑修复一夜之间在4％的煤灰，然后在20％蔗糖/ PBS过夜的地方。在-80°C和部分使用恒温器嵌入华侨城化合物，冻结。

- 在产后阶段（例如，研究树突和刺）分析：
麻醉幼仔或成年小鼠腹腔注射戊巴比妥（40-60毫克/千克）和执行transcardial灌注PBS，4％，在PBS PFA。大脑解剖的头骨和修复后，在4％的煤灰隔夜。洗涤在PBS节的大脑后，使用vibratome（100微米的部分为Dendrite分析）。安装在Aqua聚/安装的部分，用0.16-0.19毫米厚的盖玻片形象树突和刺。

8。代表结果

图3显示了电穿孔细胞在CA1区（ 图3C，D）的齿状回海马（ 图3E，F）的，在大脑皮质（ 图3A，B）的例子。野生型小鼠在E14.5与GFP的构造（PCA-B-EGFPm5消音器3），并在产后天（P）14收获的大脑电穿孔。注射1 DNA溶液的小体积（0.5μL或解决方案少1微克/微升），少数细胞被标记，允许在孤立的绿色荧光蛋白+细胞（ 图3）以及他们的棘树突状树枝状的可视化在更高的放大倍率（ 图4）。

<强>图1。电协议，可以用来研究树突和棘示意图。 （一）建设GFP的电穿孔，比较野生型和突变小鼠的树突棘。 （二）绿色荧光蛋白基因的shRNA（GFP是从相同的结构表示）电穿孔比较电穿孔用的shRNA的小鼠树突和棘建设的具体利益的基因（X）或控制的shRNA。 （三）IUE位置可以用Cre重组酶诱导系统一起，以限制的shRNA表达可取一段时间。在这个实验中，表达载体形式的Cre重组酶可以激活4 -羟基（CAG-ER ^T2 CreER ^T2的 ; 1微克/微升^）10，被用在Cre重组酶依赖特异性shRNA表达载体电穿孔方式（1微克/微升，与重组指标（CALNL-GFP结构，绿色荧光蛋白表达诱导的Cre; 1微克/微升^）10效率CY的击倒shRNA的浓度增加，以及增加造影-ER ^T2 CreER ^T2的浓度可以提高。

图2。电空间的控制。这个数字显示定位桨根据DNA注射部位的电极，以针对大脑皮层或海马。

图3。 在子宫内的树突状乔木可视电穿孔细胞在大脑皮层和海马。 （甲，乙）显示绿色荧光蛋白+在大脑皮质锥体细胞，海马CA1锥体细胞（光盘版）和（，E，F），在齿状回颗粒细胞在P14的日冕部分。 GFP的构造（PCA-B-EGFPm5消音器3）在E14.5电穿孔。高放大倍率的照片（B，D F）的显示IUE位置，是一种有效的方法来可视化的树突。比例尺（B，D和F）的代表50微米，150微米（A，C）。

图4。可视化表达构建绿色荧光蛋白在E14.5 在子宫内 ，进行电穿孔的P14的神经元的树突棘。 （甲，乙）从基础的海马锥体神经元树突棘的高倍率图像。标尺代表5微米（A）和2微米（乙）。

Discussion

IUE位置是一个功能强大的工具来操纵基因的表达，不仅在空间上，而且在时间。在这里，我们表明，这种技术可以用于可视化和基因操纵树突棘在小鼠大脑皮层和海马。除了前面提到的优点，​​值得一提的是，IUE位置，在高尔基方法的对比，可以用免疫组化或原位杂交，例如电穿孔细胞型允许结合。同样重要的是提到，此过程不会引起明显脑畸形，尽管它相对的侵袭。此外，在细胞水平上，IUE位置不修改¹³神经元的电穿孔的电生理特性。虽然我们的枝和脊椎形态的可视化示范重点，在E14.5皮质或海马神经元IUE位置也用于研究其他发展活动，如轴突的形成和指导。在添加ition，同一种协议，可以实现在胚胎发育的其他阶段，针对不同的人群。例如，在E18.5发育很晚皮质电范式可以驾驶¹星形细胞祖细胞中的表达。同样，而在E14.5海马电允许同时针对海马CA1-CA3区锥体神经元祖细胞和齿状回颗粒细胞祖，后期海马电（E18.5或产后早期）将允许针对不同的齿状回祖^14。在这种情况下，DNA的注射量可以增加以及电流强度。

IUE位置由引进的转基因似乎仍然附加体式，并因此失去了连续的细胞分裂后的细胞。然而，在分裂后的细胞，如神经元，附加体式转基因保持活跃后电击使长期研究¹³个月15。在我们的研究中，我们已经观察到明亮的绿色荧光蛋白⁺细胞7周后出生（我们分析了最新的时间点），表明胚胎针对使用IUE位置从早期发育时间点的结果，在转基因持续表达的皮质或海马神经元前体到成年。

目前的技术限制，这是很难施加罚款的电穿孔细胞总数控制。然而，我们的DNA溶液注入量减少，表明它是可能标注少数细胞和树突状树枝状可视化的孤立的GFP +细胞以及他们的刺。转染面积的尺寸，也可以通过修改如电流和脉冲数或电桨直径强度的电参数调整。

共有IUE位置是很容易实现，快速的方法，高效和体内研究树突棘。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
			注射用的针头和DNA溶液的制备
endofree质粒马克西套件	Qiagen公司	12362
快绿	西格玛	架F-7258
硼硅玻璃毛细管 1.0毫米外径×0.58 mm内径	哈佛仪器	30-0016
microloader秘诀	Eppendorf公司	5242956003	对于离心吸液管0.5μL，10μL/ 2-20微升
		＆NBSP;	手术材料
超薄虹膜剪刀	罚款科学工具	14088-10
弯钳	罚款科学工具	91197-00
环钳	罚款科学工具	11103-09
持针器	罚款科学工具	12002-12
格雷夫钳	罚款科学工具	11050-10
vicryl吸收缝合	爱惜康公司（强生）	W9074
30厘米x45厘米无菌单	巴斯特	141765
无菌棉签	shermond	HUBY-340
棉花棒	清洁跨有限公司	1860
丁丙诺啡（Vetergesic）	alstoe动物健康
clorhexidine	vetasept	XHG007
眼凝胶，涉及的	诺华公司
异氟醚	雅培公司	B506
pentoject，戊巴比妥钠20％	animalcare
			电
electroporator	A型肉毒毒素	ECM830
白金TweezertrodË5毫米	A型肉毒毒素，哈佛仪器	45-0489
femtojet微量注射器	Eppendorf公司	5247000030
脚控制Femtojet微量注射器	Eppendorf公司	5247623002
毛细管持有人	Eppendorf公司	5176190002
			组织处理
多聚甲醛	西格玛	P6148
蔗糖	VWR（Prolabo）	27480.294
显微镜载玻片	ThermoScientific（门泽尔，格拉泽）	J1800AMN​​Z
盖玻片	门泽尔，格拉泽		22×50毫米＃1,5
水族聚/安装	polysciences，公司	18606