사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

Summary

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

Abstract

utero의 electroporation에 (IUE) 배아 신경계 ^1-5의 여러 영역의 발달을 연구하는 강력한 기술이되고있다. 이 도구는 널리 세포 증식, 분화, 특히 개발하는 대뇌 피질의 연결 ^6-8에서는 마이 그 레이션의 규정을 연구하는 데 사용되었습니다 데이트를합니다. 다음은 세부의 프로토콜을 utero에서 대뇌 피질과 해마를 electroporate이 접근법은 두 대뇌 지역 dendrites 및 쪽이을 공부하는 데 사용될 수있는 증거를 제공합니다.

차 문화의 뉴런의 시각화 및 조작은 dendrite, 척추 및 시냅스 개발에 참여 과정의 더 나은 이해에 기여했습니다. 그러나 체외에서 성장 뉴런은 정상 개발하는 동안 dendrite 및 / 또는 척추 형성과 유지 보수에 영향을 미칠 수있는 모든 생리적 단서에 노출되지 않습니다. dendrite와 척추 구조의 지식 9를 사용 관찰에서 주로 온다. 그러나 잠돌군 Zz의 염색법은 예측할로 간주됩니다. 실제로 신경 세포와 섬유 책자의 그룹이 인접한 부분 염색법을 찾아볼 수없는 반면 특정 영역은 종종 완전히 스테인드 등장으로 무작위로 분류됩니다. 최근 연구 형광 구조의 IUE은 돌연변이 / 야생 형 생쥐 ^10-11 (그림 1A)에 dendrites, 쪽이뿐만 아니라 시냅스를 공부하는 매력적인 대안 방법을 대표하는 것으로 나타났습니다. 또한 마우스 knockouts의 세대에 비해, IUE는 특정 시간 창 동안 세포의 특정 인구에서 기능 연구의 이득과 손실을 수행하는 빠른 방법을 나타냅니다. 또한, IUE이 성공적으로 RNAi는 유전자 또는 shRNA ¹² 표현 이상의 시간적 제어를 수정하기 위해 접근 inducible 유전자 발현이나 inducible 함께 사용되었습니다. IUE 이러한 장점 때문에 opene했습니다D 새로운 치수뿐만 아니라 특정 대뇌 구조 (그림 1B)에서뿐만 아니라 발전의 특정 시점 (그림 1C)에 dendrites와 쪽이의 유전자 발현 / 억제의 효과를 공부할 수 있도록.

마지막으로, IUE은 dendrite, 척추 및 / 또는 시냅스 개발에 관련된 유전자 사이의 기능적 상호 작용을 식별할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 사실, 이러한 바이러스 같은 다른 유전자 전달 방법과는 달리, 그것은 세포의 동일한 인구에서 여러 RNAi 또는 transgenes을 결합하는 간단합니다.

요약에서는 IUE 이미 뇌 기능과 질병의 기본 분자 메커니즘의 특성화에 기여했으며 그것도 dendrites와 쪽이의 연구에 도움이되어야 강력한 방법입니다.

Protocol

영국에서는 마우스가 위치해 사육 및 동물 (과학적 절차) 법령 1986 하에서 홈 오피스가 승인한 가이드라인에 따라 처리됩니다.

1. 준비 : DNA의 솔루션 및 니들

1. 내독소 무료 맥시 간이 키트와 플라스미드 DNA를 정화. 물에 원하는 농도로 주입에 대한 플라스미드 DNA 용액을 준비하고 주사를 시각화하는 (0.05 %의 최종 농도) 빠른 그린에 추가합니다. electroporation의 효율이 DNA 농도에 크게 의존. 1 μg / μl의 농도는 일반적으로 사용됩니다. 이 농도는 자신의 발전에 영향을주지 않고 electroporated 뉴런을 시각화하기에 충분합니다. 그러나 플라스미드 벡터뿐만 아니라 크기와 (사이토 메갈로 바이러스 프로 모터 / 확장기, 사이토 메갈로 바이러스 프로 즉각적인 초기 확장기와 닭 β-actin업자 융합 (배속) 발기인과 강한 표현 수준이 낮은 표현 수준)에 사용되는 모터에 따라 표현 단백질의 안정성이 농도 (0.25 μg / μl ~ 5 μg / μl) 조정할 수 있습니다.
2. micropipette에 풀러를 사용하여 유리 바늘을 당기세요.

2. 외과의 작성

1. 수술기구 및 인산염 완충 식염수 (PBS)을 압력솥.
2. PBS (Buprenorphine, 30 μg / ML의 Vetergesic, 최종 농도)에 진통 솔루션을 준비합니다. 임신 마우스를 저울질하고 최소 30 분 수술 전에 Vetergesic의 subcutaneously 0.1 밀리그램 / kg를 주입. 이 기간 동안 수술 영역을 준비합니다. 가열 패드 및 복구 챔버를 켭니다. 온수 욕조, 무균 커튼의 모든 멸균 장비와 자료에 무균 PBS를 놓습니다. PBS 채워진 비커에 백금 전극을 배치하고 electroporator에 연결합니다. microloader 팁을 사용하여 DNA의 솔루션 바늘을 기입, 모세관 홀더에 바늘을 연결하고 집게로 바늘의 끝부분을 꼬집어.

유전자 주입 및 Electroporation 전에 e_title "> 3. 외과

1. 마취 유도 챔버를 사용 (산소 2리터 / 분) 산소 캐리어에서 isoflurane과 임신 마우스 (E14.5-E15.5)을 마취시키다. 동물 반사를 righting 잃는 때까지 기다리십시오.
2. "사전 수술"마스크에 동물을 전송합니다. 어머니가 전신 마취하에있는 동안 눈 각막 ulceration을 방지하기 위해 눈은 눈 젤 한 방울을 넣으십시오. 복부의 머리를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 비행 머리카락을 수집 clorhexidine으로 한 음모 지역을 청소하십시오.
3. 외과 영역의 보조 마스크에 동물을 전송합니다. 가열 패드에 미치는 뒤쪽으로 마우스를 놓습니다. 페달 반사가 손실되었습니다 수술을 시작합니다.
4. 마스크와 멸균 장갑을 끼다. 면도하고 소독되지 않은 피부의 영역에 의해 오염되는 것을 조직하고 악기를 방지하기 위해 무균 드레이프 (복부 위에 작은 구멍)으로 동물을 커버. 면도 면적을 청소하십시오적어도 t clorhexidine로 3 회. 다른 멸균 면봉 때마다 사용하십시오. 피부를 통해 중간선 (~ 1 인치 길이)을 따라 수직으로 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 가위를 사용 linea 알바 (흰색 라인은 콜라겐 결합 조직의 주로 구성)을 따라 복부의 근육과 비슷한 절개를합니다.
5. 가장 접근 배아를 선택 두 태아 사이의 고리 집게를 놓고 신중하게 복강의 밖으로 배아 사슬을 당겨. 이 시점부터는 멸균 사전 예열 PBS와 배아가 충분하게.

어떤 현미경은 시각화가 필요하지 않습니다.

4. DNA와 Electroporation의 분사

1. 쉽게 배아가 electroporated되었다 그중 추적할 만드는 가장 측면 배아들 중 하나와 함께 시작합니다. 이것이 출혈의 위험을 증가하므로 태아에 너무 많이 당기지 마십시오. 링 포셉 및 사용 amniotic SAC 내부 배아의 위치를​​ 조작고리 사이에 태아의 머리를 고정. 배아 가까워 질 벽에까지 밀어 부드럽게 짠다.
2. 다른 한편으로 모세관 홀더를 타고 측면 뇌실을 타겟으로하는 반구의 중앙으로 조심스럽게 바늘을 삽입합니다. 빠른 그린 (dendrites을 공부하기 위해 최대 1 μl)와 혼합 DNA 솔루션의 약 1 μl를 주입하기 위해 페달을 누르십시오. 당신은 측면 뇌실을 채우는 녹색 염료를 관찰해야합니다. 중요 단계 : - 바늘의 선명도가 제대로 질 벽에 피어스 중요합니다. 구멍의 확대는 양수 및 배아 사망의 유출을 초래할 것이기 때문에 그것은 자궁 벽의 표면에서, 뇌실에 삽입 후 바늘의 움직임을 최소화하는 것이 중요합니다. 이것은 출혈과 배아 죽음을 초래하므로, 이번에는 질 벽에 천공 혈관을 피하십시오.
   - 그것이 만들어 낸 것이기 때문에 그것은 측면 뇌실로의 DNA 너무 큰 볼륨을 삽입하지 않는 것이 중요뇌수종 (E14.5에서 2 μl를 초과하지 않음). DNA의 볼륨이 실험의 목적에 따라 조정됩니다. 1μl는 일반적으로 대부분의 실험에 사용되는 경우, DNA (약 0.5 μl)의 작은 볼륨은 dendrite와 척추 분석이 필요합니다. 실제로 몇 절연 세포 electroporated 뉴런의 돌기 아버을 시각화하고 측정하기 위해서는 타겟해야합니다.
3. 피질의 electroporation을위한 주입 뇌실이나 해마의 electroporation을위한 주입 뇌실 (그림 2)의 반대쪽에 동일한 측면에 긍정적인 (+) 외륜으로 태아 머리의 양쪽에 전극을 삽입합니다. 그런 다음 1 초 간격으로 다섯 30V 전기 펄스 (50 밀리초 기간)을 적용합니다. 중요 단계 : 이것은 배아 죽음을 초래하므로 태반을 통해 현재 적용하지 마십시오.
   임신 마우스의 모든 배아는 어떤 혼동을 피하기 위해 건설 보통 같은 DNA를 함께 electroporated 수 있습니다. 그러나, 긴 수술 감소 배아의 생존율이 뭐니. 복강은 30 분보다 더 열 수 없습니다.

5. 수술 후 electroporation

1. 배아를 electroporating 후 복강으로 PBS를 추가하고 원래 위치에 자궁 경적을 대체하기 위해 고리 집게를 사용합니다. Vicryl 흡수성 봉합과 복부 벽과 피부를 봉합해.
2. 그것이 가열 패드에 배치 새장에 전송 후 깨어나면 (보통 5-10 분)과까지 복구 실에서 동물을 놓습니다.

6. 이후 수술

고통, 고통이나 손해를 평가하고 수술 후 동물 24 H 48 H를 저울질하는 생쥐의 동작을 확인합니다. 필요하면 진통제는 통증과 불편을 최소화하기 위해 관리하실 수 있습니다.

7. 조직 재생

실험에 필요한 배아 또는 출생 후의 단계에 electroporated 배아 또는 새끼를 수집합니다.

ove_content "> - 배아 단계 (예를 들어 세포 증식 또는 마이 그 레이션을 공부하기)에서 분석을 위해 :
경추 탈구를 통해 어머니를 안락사와 배아를 수집합니다. 잘린 후, 올바르게 electroporated되어 두뇌를 선택한 등의 형광 신호의 크기와 위치로 표시, 형광 쌍안경을 사용하여 두개골을 통해 시각. 두개골의 두뇌를 해부하고 20 %의 자당 / 하룻밤 PBS에 4퍼센트 PFA에서 하룻밤 수정 후 곳이 네요. ° C와 섹션 그라 이오 스탯을 사용하여 -80에서 10월 화합물, 동결에 포함시킵니다.

- 출생 후의 단계 (예를 들어 dendrites 및 쪽이을 공부하는)의 분석을 위해 :
pentobarbitone의 intraperitoneal 주사 (40-60 밀리그램 / ㎏)와 새끼 또는 성인 생쥐를 마취하고 PBS에서 4퍼센트 PFA 뒤에는 PBS로 transcardial 재관류를 수행합니다. 4퍼센트 PFA 하룻밤의 두개골 및 사후 수정 프로그램의 머리를 해부. vibratome (D 100 μm의 섹션을 사용하여 PBS, 섹션 두뇌의 washings 후endrite 분석). 이미지 dendrites 및 쪽이으로 0.16-0.19 mm 두께 coverslips를 사용하여 아쿠아 폴리 / 마운트의 섹션을 탑재합니다.

8. 대표 결과

그림 3은 CA1 (그림 3C, D)과 해마 (그림 3E, F)의 이가있는 이랑의 대뇌 피질 (인물 3A, B)에서 electroporated 세포의 예제를 보여줍니다. 야생 형 생쥐는 GFP 구조 (PCA-B-EGFPm5 소음기 3)과 뇌 출생 후의 날 (P) 14시 수확했다들과 E14.5에 electroporated되었다. DNA 솔루션의 작은 부피 (1 μg / μl의 용액 0.5 μl 이하)를 주입함으로써, 몇 전지 절연 GFP + 세포 (그림 3)뿐만 아니라 그 쪽이의 돌기 arborization의 시각화을 허용하는 레이블이 있습니다 높은 배율에서 (그림 4).

<강한> 그림 1. dendrites 및 쪽이을 공부하는 데 사용할 수 electroporation 프로토콜의 도식 표현. () GFP의 Electroporation은 야생 형 및 돌연변이 생쥐에서 dendrites 및 쪽이을 비교하기 위해 구축. (B) GFP-shRNA (GFP가 같은 구조로 표현된다)의 Electroporation은 건설 dendrites과 shRNA으로 electroporated 생쥐의 쪽이을 비교하는 관심의 유전자 (X) 또는 제어 shRNA 특정. (C) IUE는 바람직한 기간에 shRNA 표현을 제한하기 위해 Cre의 inducible 시스템을 함께 사용할 수 있습니다. 본 실험에서는 벡터는 4 hydroxytamoxifen에 의해 활성화될 수 Cre의 recombinase의 형태 표현 (를 배속-ER ^T2 CreER ^T2, 1 μg / μl) ^10은 Cre 부양의 특정 shRNA을 표현 벡터 함께 electroporated있다 방식 (1 μg / μl, 그리고 재조합 표시기 (Cre에 의한 CALNL-GFP 구조, GFP의 발현 inducible와;. 1 μg / μl) ¹⁰ efficien최저의 사는 shRNA의 농도를 증가뿐만 아니라 배속-ER ^T2 CreER ^T2 농도를 높임으로써 향상시킬 수 있습니다.

그림 2. electroporation의 공간적 제어합니다. 이 수치는 대뇌 피질이나 해마를 타겟으로하기 위해 DNA를 주입 사이트에 따르면 패들 전극을 배치하는 위치를 보여줍니다.

그림 3. utero에의 돌기 아버의 시각화는 대뇌 피질과 해마에서 세포를 electroporated. (A, B) GFP + 대뇌 피질의 피라미드 세포 (CD) 피라미드 해마의 CA1에있는 세포 및 (E, F), P14에서 이가있는 이랑의 과립 세포를 보여주는 코로나 섹션. GFP 구조 (PCA-B-EGFPm5 소음기 3) E14.5에서 electroporated되었다. 높은 배율 사진 (B, D, F)는 IUE가 dendrites을 시각화하기위한 효율적인 방법임을 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm의 (B, D 및 F), 150 μm의합니다 (A, C, E) 나타냅니다.

그림 4. 구축을 표현 GFP와 E14.5에 utero에 electroporated되었다 P14 뉴런의 돌기 쪽이의 시각화. (A, B) hippocampal 피라미드 뉴런의 기저 dendrites에서 쪽이 높은 배율 이미지. 스케일 바는 5 μm의 (A) 및 2 μm의를 (B) 나타냅니다.

Discussion

IUE가 우주에서뿐만 아니라 시간뿐만 아니라 유전자 발현을 조작하기위한 강력한 도구입니다. 우리는이 기술은 대뇌 피질과 생쥐의 해마에서 dendrites 및 쪽이을 시각화하고 유전자 조작하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시됩니다. 이전에 인용된 장점 외에, 그것은 IUE이 방법을 잠돌군 Zz와는 달리, immunohistochemistry이나 표현형 electroporated 세포에 대한 예를 들어 허용 원위치 하이브리드화에서 조합하여 사용할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 절차는 상대적 invasiveness에도 불구하고 분명 뇌의 기형을 유발하지 않는다는 언급하는 것도 중요합니다. 또한, 세포 수준에서 IUE는 electroporated 뉴런 ¹³ electrophysiological 속성을 수정하지 않습니다. 우리의 시위가 dendrite와 척추 morphologies의 시각화에 초점을 맞춘 반면, E14.5에서 대뇌 피질이나 hippocampal 뉴런의 IUE은 또 축삭 형성과지도와 같은 다른 발달 이벤트를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 추가할에서ition, 프로토콜의 같은 종류의 서로 다른 인구를 대상으로 배아 발달의 다른 단계에서 구현할 수 있습니다. 예를 들어, E18.5의 발달 늦게 피질 electroporation 패러다임은 astrocytic progenitors ¹ 식을 운전을 수행할 수 있습니다. E14.5에서 해마의 electroporation도 같은 시간에 CA1-CA3 피라미드 신경 세포의 progenitors과 이가있는 과립 세포 시조를 타겟팅할 수있는 동안 마찬가지로, 늦은 hippocampal electroporation은 (E18.5 또는 초기 출생 후의) 다른 이가있는 과립에 게재되는 것을 허용 것이다 progenitors ^14. 이 경우, DNA의 주입 부피는 전류의 강도뿐만 아니라 증가 수 있습니다.

IUE에 의해 도입된 Transgenes는 episomal 유지 것으로 보인다 따라서 연속적으로 세포 분열에 따라 세포에서 손실됩니다. 이러한 뉴런과 같은 postmitotic 세포 그러나 episomal transgenes는 장기적인 연구를 할 수 있도록 ¹³ electroporation 후 몇 달 동안 활성 상태로 유지15. 우리의 연구에서 우리는 초기 개발 시간 지점에서 transgene의 영구 식에 IUE 결과를 이용하여 대뇌 피질이나 hippocampal의 연결을 엽 성의 전구 물질을 목표로 그 배아를 나타내는 출산 후 칠주 (우리가 분석한 최신 시점)에 밝은 GFP ⁺ 세포를 관찰했습니다 성인 있습니다.

기술의 현재의 한계는 그것이 electroporated 세포의 총수 이상의 미세 제어를 발휘하기 어렵다는 점이다. 그러나 DNA 솔루션의 주입 부피를 줄임으로써, 우리는 몇 세포 레이블을 지정하고 고립된 GFP + 세포뿐만 아니라 쪽이의 돌기 arborization을 시각화하는 것이 가능하는 것으로 나타났습니다. transfected 영역의 차원은 또 현재와 펄스의 숫자 또는 electroporation의 심폐의 직경의 강도 등 electroporation의 매개 변수를 수정하여 조정할 수있다.

개의 IUE는 구현하기가 쉽고 빠른있는 방법이며,생체내의 dendrites 및 쪽이을 공부하는 효율.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
			주사 바늘와 DNA 솔루션의 준비
Endofree 플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12,362
빠른 그린	시그마	F-7258
Borosilicate 유리 모세관 1.0 mm OD X 0.58 밀리미터 아이디	하버드 장치	30-0016
Microloader 팁	Eppendorf	5242956003	Eppendorf 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl를 pipettes 내용
		& NBSP;	수술 재료
추가 얇은 홍채 가위	파인 과학 도구	14088-10
곡선 집게	파인 과학 도구	91197-00
링 포셉	파인 과학 도구	11103-09
니들 홀더	파인 과학 도구	12002-12
Graefe 집게	파인 과학 도구	11050-10
Vicryl 흡수성 봉합사	Ethicon INC (존슨 앤 존슨)	W9074
멸균 커튼 30cm X 45cm	버스터	141,765
멸균 면봉	Shermond	HUBY-340
목화 꽃봉오리	클린 크로스 유한 공사	1860
Buprenorphine (Vetergesic)	Alstoe 동물 건강
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
아이 겔 Viscotears	노바티스
Isoflurane	애보트 래버러토리스	B506
Pentoject, Pentobarbitone 나트륨 20%	Animalcare
			Electroporation
Electroporator	BTX	ECM830
플래티넘 Tweezertrod전자 5mm	BTX, 하버드 장치	45-0489
Femtojet microinjector	Eppendorf	5247000030
Femtojet Microinjector을위한 발 관리	Eppendorf	5247623002
모세관 홀더	Eppendorf	5176190002
			조직 재생
Paraformaldehyde	시그마	P6148
자당	VWR (Prolabo)	27480.294
현미경 슬라이드	ThermoScientific (Menzel-Gläser)	J1800AMN​​Z
Coverslips	Menzel-Gläser		22 X 50mm # 1.5
아쿠아 폴리 / 마운트	Polysciences, INC	18,606