להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Summary

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

Abstract

ב electroporation ברחם (IUE) הפך טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של אזורים שונים של מערכת העצבים העוברית ^1-5. עד היום בכלי זה נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את הרגולציה של התפשטות התמיינות, וכן העברה עצבית בעיקר את קליפת המוח המתפתח ^6-8. כאן יש פירוט הפרוטוקול שלנו electroporate ברחם קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס לספק ראיות כי גישה זו ניתן ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

ויזואליזציה ומניפולציה של נוירונים תרבויות עיקריות תרמו להבנה טובה יותר של התהליכים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ופיתוח סינפסה. עם זאת נוירונים הגדלים במבחנה אינם חשופים כל סימנים פיזיולוגיים שיכולים להשפיע על דנדריט ו / או יצירת עמוד השדרה ותחזוקה במהלך התפתחות תקינה. הידע שלנו של מבנים דנדריט ועמוד השדרה 9. עם זאת, מכתים Golgi נחשב בלתי צפוי. אכן, קבוצות של תאים עצביים ועל קטעי סיבים מסומנים באופן אקראי, עם אזורים מסוימים מופיעה לעתים קרובות מוכתם לחלוטין בעוד אזורים סמוכים ללא כתמים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי IUE של מבנים ניאון מהווה שיטה חלופית אטרקטיבית ללמוד דנדריטים, עמוד שדרה, כמו גם את הסינפסות עכברים שעברו מוטציה / wild-type ^10-11 (איור 1 א). יתר על כן, בהשוואה לדור של knockouts עכבר, IUE מייצג גישה מהירה לבצע רווח והפסד של מחקרים פונקציה באוכלוסייה ספציפית של תאים במהלך חלון זמן מסוים. בנוסף, IUE שימש בהצלחה עם ביטוי הגן או מושרה מושרה RNAi מתקרב כדי לחדד את השליטה הזמני על הביטוי של הגן או shRNA ^12. אלו יתרונות יש IUE ובכך openeד מימדים חדשים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי גנים / דיכוי על דנדריטים עם קוצים לא רק מבנים מוחיים ספציפיים (איור 1 ב), אלא גם בנקודת זמן מסוימת של פיתוח (איור 1 ג).

לבסוף, IUE מספקת כלי יעיל לזהות אינטראקציות תפקודית בין גנים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ו / או פיתוח סינפסה. ואכן, בניגוד לשיטות אחרות העברת גנים כמו וירוס, זה פשוט לשלב מספר רב של RNAi או transgenes באוכלוסייה זהה של תאים.

לסיכום, IUE היא שיטה רבת עוצמה אשר תרמו כבר אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד המוח ומחלות והיא צריכה להיות שימושית גם במחקר של דנדריטים עמוד השדרה.

Protocol

בבריטניה, עכברים הם שוכנו, התרבו, וטופלו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי משרד הפנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) משנת 1986.

1. אופן ההכנה: פתרון ה-DNA ואת מחטים

1. לטהר את הדנ"א פלסמיד עם ערכת רעלן פנימי חינם Maxi-Prep. הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד להזרקה לריכוזים הרצויים במים ולהוסיף גרין מהירה (הריכוז הסופי של 0.05%) לדמיין זריקות. היעילות של electroporation תלויה מאוד ריכוז ה-DNA. ריכוז של 1 מיקרוגרם / μl משמש בדרך כלל. ריכוז זה מספיק לדמיין נוירונים electroporated מבלי להשפיע על התפתחותם. עם זאת, על פי מקדם משמש וקטור פלסמיד (רמת ביטוי נמוכה עם האמרגן ציטומגלווירוס / משפר, רמת ביטוי חזק עם ציטומגלווירוס מיידית משפר מוקדם עוף β-אקטין היתוך האמרגן (החטיבה) האמרגן), כמו גם את הגודל היציבות של החלבון לידי ביטוי, ריכוז זה יכול להיות מותאם (0.25 מיקרוגרם / μl עד 5 מיקרוגרם / μl).
2. משוך מחטים זכוכית באמצעות חולץ micropipette.

2. הכנת הניתוח

1. החיטוי מכשירי ניתוח וכן מאגר מלוחים פוספט (PBS).
2. הכן פתרון כאבים ב PBS (עצירות, ריכוז Vetergesic, האחרון של 30 מיקרוגרם / מ"ל). לשקול את העכבר בהריון להזריק תת עורית 0.1 מ"ג / ק"ג של Vetergesic לפחות 30 דקות לפני הניתוח. במהלך תקופה זו, להכין את אזור הניתוח. הפעלת כריות חימום ובית הנבחרים התאוששות. מניחים PBS סטרילית באמבט מים חמים כל כלי סטריליים וחומרים על בסדינים מעוקרים. הנח את האלקטרודות לתוך הכוס פלטינה PBS מלא ולהתחבר electroporator. מלאו את המחט עם פתרון ה-DNA באמצעות עצה microloader, חבר את המחט לבעל נימי ולצבוט את קצה המחט עם מלקחיים מספר.

e_title "> 3. ניתוח לפני הזרקת ה-DNA ואת electroporation

1. לטשטש את העכבר בהריון (E14.5-E15.5) עם isoflurane במנשא החמצן (חמצן 2 ליטר / דקה) באמצעות חדר אינדוקציה הרדמה. לחכות עד שבעל החיים מאבד ליישר רפלקס.
2. להעביר את בעל החיים מסכה "טרום ניתוח". מניחים טיפת ג'ל עיניים על כל עין כדי למנוע כיב בקרנית העיניים בזמן שאמא נמצאת תחת הרדמה כללית. להשתמש במכונת גילוח חשמלית לגלח את השיער של הבטן. לנקות את האזור המגולח פעם עם clorhexidine לאסוף שיער המעופף.
3. להעביר את בעל החיים המסכה 2 באזור הניתוח. מניחים את העכבר עם גבו על כרית חימום. להתחיל את הניתוח כאשר רפלקס דוושת אבד.
4. ללבוש מסכה וכפפות סטריליות. כסה את בעל החיים עם וילון סטרילי (עם חור קטן על הבטן) כדי למנוע את רקמות וכלי מלהיות מזוהמים על ידי אזורים של עור שלא היה מגולח וחיטוי. לנקות את האזור מגולחלא לפחות 3 פעמים עם clorhexidine. השתמש מקלון צמר גפן סטרילי שונה בכל פעם. השתמש אזמל לעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע (~ 1 ס"מ אורך) דרך העור. באמצעות מספריים, לעשות חתך דומה של שריר הבטן לאורך Linea alba (הקו הלבן מורכב ברובו רקמת החיבור קולגן).
5. בחר את העוברים נגיש ביותר למקם את מלקחיים טבעת בין שני העוברים ובזהירות למשוך את השרשרת עובריים מתוך חלל הבטן. מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים hydrated עם סטרילי מחומם מראש PBS.

מיקרוסקופ לא נדרש להדמיה.

4. הזרקת דנ"א electroporation

1. להתחיל עם אחד העוברים לרוחב ביותר, מה שמקל כדי לעקוב אחר שבו היו עוברים electroporated. אל תמשוך יותר מדי על העוברים כמו זה יהיה להעלות את הסיכון של דימום. לשנות את המיקום של העובר בתוך שק מי השפיר באמצעות מלקחיים הטבעת והכבישיםלייצב את הראש של העוברים בין הטבעות. סוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב יותר לקיר הרחם.
2. עם זאת, לקחת את בעל נימי והכנס את המחט בזהירות למרכז בחצי הכדור לכוון החדר לרוחב. לחצו על הדוושה כדי להזריק כ 1 μl של פתרון ה-DNA מהול מהיר (פחות מ 1 μl ללמוד דנדריטים) הירוק. אתה צריך לראות את הצבע הירוק ממלא את החדר לרוחב. צעדים קריטיים: - חדות של מחט הוא קריטי כדי לחדור כראוי קיר הרחם. חשוב למזער את תנועת המחט על פני השטח של דופן הרחם ואחרי הכניסה לתוך החדר, כי הגדלת החור תגרום דליפת מי שפיר או מוות העובר. הימנע דם פירסינג הכלים דופן הרחם, כמו זה יגרום לדימום ומוות העובר.
   - חשוב לא להזריק כמות גדולה מדי של ה-DNA לתוך החדר לרוחב כי זה יהיה לגרוםהידרוצפלוס (לא יעלה על 2 μl ב E14.5). נפח של ה-DNA מותאם לפי המטרה של הניסוי. אם 1μl משמש בדרך כלל את רוב הניסויים, נפח קטן יותר של ה-DNA (כ 0.5 μl) נדרש דנדריט ניתוח בעמוד השדרה. ואכן כמה תאים בודדים צריך להיות ממוקד כדי לחזות ולמדוד את סוכת הדנדריטים של נוירונים electroporated.
3. הנח את האלקטרודות בצידי הראש עובר עם משוט (+) חיובי בצד כמו החדר מוזרק עבור electroporation קליפת המוח או בצד השני של החדר מוזרק עבור electroporation ההיפוקמפוס (איור 2). לאחר מכן ליישם חמש פולסים חשמליים 30V (50 msec ומשך) בשעה 1 במרווחים שניות. צעד קריטי: הימנע החלת הנוכחי על פני השליה כמו זה יהיה לגרום למוות העובר.
   כל העוברים בתוך העכבר בהריון ניתן electroporated, בדרך כלל עם ה-DNA זהה לבנות כדי למנוע בלבול. עם זאת, ירידה ניתוח רב של שיעור ההישרדות של עוברים. חלל הבטן אין לפתוח יותר מ 30 דקות.

5. ניתוח שלאחר electroporation

1. לאחר electroporating את העוברים, להוסיף PBS לתוך חלל הבטן ולהשתמש מלקחיים טבעת להחליף את קרן הרחם במיקומו המקורי. לתפור קיר הבטן והעור עם התפרים נספגים Vicryl.
2. מניחים את החיה בחדר ההתאוששות עד שהוא מתעורר (בדרך כלל 5-10 דקות) ולאחר מכן להעביר בכלוב מונח על כרית חימום.

6. לאחר הניתוח

בדוק את התנהגות העכברים להעריך, סבל או מצוקה ולשקול את החיות 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח. במידת הצורך, משככי כאבים יכולים להינתן כדי למזער את הכאב ואי הנוחות.

7. עיבוד רקמות

לאסוף את עוברי electroporated או גורים בשלבים עובריים או לאחר הלידה הנדרשים לניסוי.

ove_content "> - לניתוח בשלבים עובריים (למשל ללמוד התפשטות תאים או הגירה):
האם להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם ולאסוף את העוברים. לאחר עריפת ראש, בחר את המוח, כי כבר electroporated כראוי, כפי שמעידה כמות ומיקום של אות ניאון, דמיינו פני הגולגולת באמצעות המשקפת ניאון. לנתח את המוח של הגולגולת ולתקן לילה PFA 4% ולאחר מכן מקום סוכרוז 20% / PBS לילה. שבץ במתחם אוקטובר, הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס, תוך שימוש בסעיף cryostat.

- לניתוח בשלבים לאחר הלידה (למשל ללמוד דנדריטים עמוד השדרה):
להרדים גורים או עכברים בוגרים עם הזרקת intraperitoneal של pentobarbitone (40-60 מ"ג / ק"ג) ולבצע זלוף transcardial עם PBS, ואחריו PFA 4% ב PBS. לנתח את המוח של הגולגולת ואחרי תיקון ב 4% PFA לילה. לאחר כביסות ב PBS, סעיף המוח באמצעות vibratome (סעיפים 100 מיקרומטר עבור דendrite ניתוח). הר את הסעיפים אקווה פולי / הר באמצעות 0.16-0.19 coverslips מ"מ עובי על דנדריטים התמונה ואת עמוד השדרה.

8. נציג תוצאות

איור 3 מציג דוגמאות של תאים electroporated בקליפת המוח (3A דמויות, ב), CA1 (איורים 3 ג, ד) וכן gyrus משוננת של ההיפוקמפוס (איורים 3E, F). Wild-type עכברים היו electroporated ב E14.5 עם מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) ומוח נבצרו ב יום לאחר הלידה (p) 14. על ידי הזרקת נפח קטן של פתרון ה-DNA (0.5 μl פחות או פתרון ב מיקרוגרם 1 / μl), תאים כמה מסומנים, אשר מאפשר הדמיה של arborization הדנדריטי של בודדים GFP + תאים (איור 3), כמו גם עמוד שדרה בהגדלה גבוהה יותר (איור 4).

באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקולים electroporation שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דנדריטים עמוד השדרה. (א) electroporation של ה-GFP בונים להשוות דנדריטים עמוד שדרה אצל עכברים wild-type ו מוטציה. (ב) electroporation של ה-GFP-shRNA (GFP מתבטא בין מבנה זהה) להשוות דנדריטים הקוצים עכברים electroporated עם shRNA לבנות ספציפית הגן של עניין (X) או shRNA שליטה. (ג) IUE יכול לשמש יחד עם מערכת מושרה Cre כדי להגביל ביטוי shRNA תקופת זמן רצויה. בניסוי זה, וקטור לבטא סוג של recombinase Cre שיכול להיות מופעל על ידי 4-hydroxytamoxifen (החטיבה ^ER-T2 קואל ^T2: 1 מיקרוגרם / μl) ^10, הוא electroporated יחד עם הווקטור המבטא shRNA ספציפי תלויה Cre באופן (1 מיקרוגרם / μl, ועם מדד רקומבינציה (CALNL-GFP מבנה, מושרה GFP ביטוי על ידי Cre,. 1 מיקרוגרם / μl) ¹⁰ efficienסי של מציאה ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז shRNA כמו גם הגדלת החטיבה ^ER-T2 ריכוז קואל ^T2.

איור 2. השליטה במרחב של electroporation. נתון זה מראה היכן למקם את האלקטרודות ההנעה על פי הזריקה ה-DNA על מנת למקד את קליפת המוח או ההיפוקמפוס.

איור 3. ויזואליזציה של ארבור הדנדריטי של ברחם electroporated תאים בקליפת המוח להיפוקמפוס מוחין. (א, ב) סעיפים העטרה מראה GFP + תאים פירמידליים בקליפת המוח, (CD) תאים פירמידליים ב CA1 של ההיפוקמפוס ו (E, F), תאים גרגיר של gyrus משוננת ב P14. מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) היה electroporated ב E14.5. תמונות הגדלה גבוהה (B, D, F) עולה כי IUE היא שיטה יעילה לחזות דנדריטים. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר (B, D ו-F), 150 מיקרומטר (A, C, E).

איור 4. ויזואליזציה של הקוצים הדנדריטים ב p14 נוירונים שהיו electroporated ברחם ב E14.5 עם GFP להביע לבנות. (A, B) תמונות בהגדלה גבוהה של עמוד השדרה של הבסיס דנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס פירמידליים. ברים בקנה מידה מייצגים 5 מיקרומטר (א) ו -2 מיקרומטר (ב ').

Discussion

IUE הוא כלי רב עוצמה כדי לתפעל ביטוי גנים לא רק במרחב אלא גם בזמן. אנחנו מראים כאן טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להמחיש גנטית לתפעל דנדריטים הקוצים בקליפת המוח ו בהיפוקמפוס של עכברים. מלבד היתרונות שצוינו לעיל, ראוי לציין כי IUE, בניגוד Golgi השיטה, ניתן לשלב עם אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרו, מה שמאפשר למשל פנוטיפ התאים electroporated. כמו כן, חשוב לציין כי הליך זה אינו לגרום מומים במוח שנרשמה למרות הפולשנות היחסי. בנוסף, ברמה התאית, IUE לא לשנות את המאפיינים של אלקטרו נוירונים electroporated ^13. בעוד ההפגנה שלנו מתמקד להדמיה של מורפולוגיות דנדריט ועמוד השדרה, IUE של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס ב E14.5 יכול לשמש גם כדי ללמוד את אירועי התפתחותיות אחרות כגון היווצרות האקסון והדרכה. בהוספהition, אותו סוג של פרוטוקול יכול להיות מיושם בשלבים אחרים של ההתפתחות העוברית למקד אוכלוסיות שונות. לדוגמה, הפרדיגמה electroporation התפתחותית מאוד קליפת המוח מאוחר E18.5 ניתן לבצע לנהוג ביטוי אבות astrocytic ^1. באופן דומה, תוך electroporation של ההיפוקמפוס ב E14.5 מאפשר למקד-CA1 CA3 אבות נוירונים פירמידליים ו אב משוננת גרעין התא בו זמנית, electroporation ההיפוקמפוס מאוחר (E18.5 או לאחר לידה מוקדמת) תאפשר למקד גרגיר משוננת שונה אבות ^14. במקרה זה, נפח מוזרק של ה-DNA יכול לגדול, כמו גם האינטנסיביות של הנוכחי.

Transgenes הציג IUE מופיעים להישאר episomal והם איבדו ולכן מתאים בעקבות חלוקות עוקבות. בתאים postmitotic כמו נוירונים, לעומת זאת, את transgenes episomal יישאר פעיל במשך חודשים לאחר electroporation המאפשר מחקרים ארוכי טווח ¹³, 15. במחקר שלנו, ראינו GFP בהיר ⁺ תאים עד 7 שבועות לאחר הלידה (נקודת הזמן האחרונה ניתחנו) המצביעים על כך עובריים המיקוד של מבשרי נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס באמצעות תוצאות IUE בביטוי מתמשך של transgene מן המוקדמות נקודות זמן התפתחותיים עד לבגרות.

המגבלה הנוכחית של הטכניקה היא כי קשה להפעיל בקרה טובה על המספר הכולל של תאים electroporated. עם זאת, על ידי הפחתת נפח מוזרק של פתרון ה-DNA, הראינו כי ניתן לסמן מספר תאים ו לדמיין arborization הדנדריטים של תאים מבודדים + GFP, כמו גם עמוד שדרה. מימד של האזור transfected יכול גם להיות מותאם על ידי שינוי הפרמטרים של electroporation כגון עוצמת הזרם ומספר פעימות או בקוטר של משוטים electroporation.

בסך הכל IUE היא שיטה כי הוא קל ליישום, מהיריעיל ללמוד דנדריטים הקוצים vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
			הכנת מחטים פתרון ה-DNA של הזרקה
Endofree ערכת מקסי פלסמיד	Qiagen	12362
מהיר גרין	סיגמא	F-7258
ההתכה של זכוכית בורו נימים 1.0 מ"מ OD x 0.58 מ"מ מזהה	הרווארד Apparatus	30-0016
Microloader טיפים	Eppendorf	5242956003	עבור Eppendorf טפטפות 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl
		& Nbsp;	חומר לניתוח
דקות נוספות איריס מספריים	מדע כלים עדינים	14088-10
מעוקלים מלקחיים	מדע כלים עדינים	91197-00
טבעת מלקחיים	מדע כלים עדינים	11103-09
מחט בעל	מדע כלים עדינים	12002-12
גרפה מלקחיים	מדע כלים עדינים	11050-10
תפר נספג Vicryl	Ethicon Inc (Johnson & Johnson)	W9074
בסדינים מעוקרים 30 ס"מ x 45 ס"מ	באסטר	141765
מטליות סטריליות	Shermond	HUBY-340
כותנה ניצנים	נקי הצלב ושות' בע"מ	1860
עצירות (Vetergesic)	Alstoe לבריאות בעלי חיים
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
ג'ל עיניים Viscotears	נוברטיס
Isoflurane	אבוט מעבדות	B506
Pentoject, נתרן Pentobarbitone 20%	Animalcare
			Electroporation
Electroporator	BTX	ECM830
פלטינום Tweezertrod5 מ"מ דואר	BTX, הרווארד Apparatus	45-0489
Femtojet microinjector	Eppendorf	5247000030
שליטה ברגל Femtojet Microinjector	Eppendorf	5247623002
נימי בעל	Eppendorf	5176190002
			עיבוד רקמות
Paraformaldehyde	סיגמא	P6148
סוכרוז	VWR (Prolabo)	27480.294
מיקרוסקופ שקופיות	ThermoScientific (מנצל-גלזר)	J1800AMNZ
Coverslips	מנצל-גלזר		22 x 50 מ"מ # 1,5
אקווה פולי / הר	Polysciences, Inc	18606