Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

Summary

Denne artikkelen beskriver i detalj en protokoll til electroporate i utero hjernebarken og hippocampus hos E14.5 i mus. Vi viser også at dette er en verdifull metode for å studere dendritter og pigger i disse to cerebrale regioner.

Abstract

I fosterlivet electroporation (IUE) har blitt en effektiv teknikk for å studere utviklingen av ulike regioner av embryonale nervesystemet ^1-5. Hittil dette verktøyet har vært mye brukt til å studere reguleringen av cellulær proliferasjon, differensiering og neuronal migrasjon spesielt i utviklingsland hjernebarken ^6-8. Her har vi detalj vår protokoll til electroporate i utero hjernebarken og hippocampus og gi bevis for at denne tilnærmingen kan brukes til å studere dendritter og pigger i disse to cerebrale regioner.

Visualisering og manipulering av nerveceller i primære kulturer har bidratt til en bedre forståelse av prosessene som er involvert i dendrite, ryggraden og synapse utvikling. Men nevroner voksende in vitro ikke utsettes for alle de fysiologiske signaler som kan påvirke dendrite og / eller ryggrad dannelse og vedlikehold under normal utvikling. Vår kunnskap om dendrite og ryggrad strukturer 9. Men Golgi flekker anses å være uforutsigbar. Faktisk er grupper av nerveceller og fiber traktater merket tilfeldig, med spesielle områder ofte vises helt beiset mens tilstøtende områder er blottet for farging. Nyere studier har vist at IUE av fluorescerende konstruksjoner representerer et attraktivt alternativ metode for å studere dendritter og pigger samt synapser i mutant / villtype mus ^10-11 (figur 1A). Videre i forhold til produksjon av mus knockouts, representerer IUE en rask tilnærming til å utføre gevinst og tap av funksjon studier i spesifikke populasjon av celler i løpet av en bestemt tid vindu. I tillegg har IUE blitt brukt med induserbar genekspresjon eller induserbar RNAi tilnærmingsmåter for å avgrense tidsmessige kontroll over uttrykket av et gen eller shRNA ^12. Disse fordeler IUE har dermed opened nye dimensjoner for å studere effekten av genuttrykk / undertrykking på dendritter og ryggrader ikke bare i spesifikke cerebrale strukturer (Figur 1B), men også på et bestemt tidspunkt i utviklingen (figur 1C).

Til slutt gir IUE et nyttig verktøy for å identifisere funksjonelle samspillet mellom gener involvert i dendrite, ryggrad og / eller synapse utvikling. Faktisk, i motsetning til andre genoverføring metoder som virus, er det enkelt å kombinere flere RNAi eller transgener i samme populasjon av celler.

Oppsummert er IUE en kraftig metode som allerede har bidratt til karakterisering av molekylære mekanismene bak hjernens funksjon og sykdom, og det bør også være nyttig i studiet av dendritter og pigger.

Protocol

I Storbritannia, er mus plassert, oppdrettet, og behandles i henhold til retningslinjer godkjent av Home Office under Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Forberedelse: DNA Solution og Needles

1. Rense plasmid DNA med en Endotoksin gratis Maxi-prep kit. Forbered plasmid DNA injeksjonsvæske til ønskede konsentrasjoner i vann og tilsett Fast Green (endelig konsentrasjon på 0,05%) for å visualisere injeksjoner. Effektiviteten av electroporation er svært avhengig av DNA konsentrasjon. En konsentrasjon av en mikrogram / mL er vanligvis brukt. Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å visualisere electroporated nevroner uten at det påvirker deres utvikling. Men ifølge arrangøren brukt i plasmidet vektor (lavt uttrykk nivå med cytomegalovirus promoter / enhancer, sterkt uttrykk nivå med cytomegalovirus umiddelbar tidlig enhancer og kylling β-actin promoter fusion (CAG) promoter) samt størrelse og stabilitet av proteinet uttrykt, kan denne konsentrasjonen justeres (0,25 mikrogram / mL til 5 mikrogram / mL).
2. Trekk glass nåler ved hjelp av en mikropipette avtrekker.

2. Klargjøring av kirurgi

1. Autoklaver kirurgiske instrumenter og fosfatbuffer saltvann (PBS).
2. Forbered smertestillende løsning i PBS (Buprenorfin, Vetergesic, endelig konsentrasjon på 30 mikrogram / ml). Vei den gravide mus og injisere subkutant 0,1 mg / kg av Vetergesic minst 30 minutter før operasjonen. I løpet av denne tiden, forberede kirurgisk område. Slå på Varmeplatene og utvinning kammermusikk. Plasser sterile PBS i varmt vannbad og alle sterile instrumenter og materialer på sterile forheng. Plasser platina elektroder i en PBS fylt begerglass og koble til electroporator. Fyll nålen med DNA løsningen ved hjelp av en microloader spissen, kobler du nålen til kapillær holderen og klemme av nålespissen med en tang.

e_title "> 3. Kirurgi Før DNA Injection og electroporation

1. Anaesthetize en gravid mus (E14.5-E15.5) med isofluran i oksygen carrier (oksygen 2 l / min) med en bedøvelse induksjon kammer. Vent til dyret mister kjøl refleks.
2. Overfør dyret til en "pre-kirurgi" maske. Plasser en dråpe øye gel på hvert øye for å hindre hornhinnesår av øynene mens moren er under narkose. Bruk en elektrisk barbermaskin for å barbere håret på magen. Rengjør det barberte området én gang med clorhexidine å samle flyvende hår.
3. Overfør dyret til en andre maske i det kirurgiske området. Plasser musen med ryggen til varmeputen. Start kirurgi når pedalen refleks har gått tapt.
4. Ta på masken og sterile hansker. Dekk dyret med en steril drapere (med et lite hull over magen) for å hindre at vev og instrumenter blir forurenset av de områdene av huden som ikke har blitt barbert og desinfisert. Rengjør det barberte området ent minst 3 ganger med clorhexidine. Bruk en annen steril bomullspinne hver gang. Bruk en skalpell til å lage en vertikal snitt langs midtlinjen (~ 1 cm lang) gjennom huden. Ved hjelp av saks, gjør en tilsvarende innsnitt av muskelen i magen langs linea alba (hvit linje består hovedsakelig av kollagen bindevev).
5. Velg de mest tilgjengelige embryoer og plassere ring tang mellom to embryoer og dra forsiktig embryonale kjeden ut av bukhulen. Fra dette punktet, holde embryoene hydrert med steril forvarmes PBS.

Ingen mikroskop er nødvendig for visualisering.

4. Injeksjon av DNA og electroporation

1. Start med en av de mest laterale embryoene, noe som gjør det lettere å holde styr på hvilke embryoer ble electroporated. Ikke trekk for mye på de embryoene som dette vil øke risikoen for blødning. Manipulere plasseringen av embryo inne i amniotic sac bruke ring tang ogstabilisere hodet av embryoene mellom ringene. Klem forsiktig å presse opp embryoet nærmere livmorveggen.
2. Med den andre hånden, ta kapillær holderen og sett nålen forsiktig inn i midten av halvkulen å målrette den laterale ventrikkelen. Trykk på pedalen for å injisere ca 1 mL av DNA løsning blandet med Fast Green (mindre enn 1 mL å studere dendritter). Du bør observere den grønne fargestoffet fylle den laterale ventrikkelen. Kritiske trinn: - gjengivelsen av nålen er kritisk til pierce ordentlig livmorveggen. Det er viktig å minimere bevegelse av nålen på overflaten av livmor veggen og etter innsetting i ventrikkelen fordi en utvidelse av hullet vil resultere i lekkasje av fostervann og embryo død. Unngå piercing blodårer i livmorveggen, da dette vil resultere i blødninger og embryo død.
   - Det er viktig ikke å injisere for stort volum av DNA inn i laterale ventrikkelen fordi det vil forårsakehydrocephalus (ikke overstige 2 mL ved E14.5). Volumet av DNA er justert i henhold til formålet med forsøket. Hvis 1μl brukes vanligvis for de fleste eksperimenter, er et mindre volum av DNA (ca. 0,5 mL) som kreves for dendrite og ryggrad analyse. Faktisk noen isolerte cellene trenger for å være målrettet for å visualisere og måle dendrittiske arbor av electroporated nerveceller.
3. Plasser elektrodene på sidene av embryoet hodet med den positive (+) padle på samme side som injiseres ventrikkelen for cortex electroporation eller på motsatt side av den injiserte ventrikkel for hippocampus electroporation (figur 2). Påfør deretter fem 30V elektriske pulser (50 msek varighet) på 1 sek mellomrom. Kritisk trinn: Unngå å bruke strøm på tvers av morkaken som dette vil resultere i embryodød.
   Alle embryoene i en gravid mus kan electroporated, vanligvis med samme DNA konstruere for å unngå eventuelle misforståelser. Men en lang operasjon nedgang er den overlevelse av embryo. Bukhulen bør ikke åpnes lenger enn 30 min.

5. Kirurgi Post-electroporation

1. Etter electroporating embryoene, legger PBS i bukhulen og bruke ring tang for å erstatte livmor horn i sin opprinnelige plassering. Suture magen veggen og hud med Vicryl absorberbare suturer.
2. Plasser dyret i et recovery kammer før det våkner opp (vanligvis 5-10 min) og deretter overføre i et bur plassert på en varmepute.

6. Post-kirurgi

Sjekk oppførsel av mus for å vurdere smerte, lidelse eller nød og veie dyrene 24 h og 48 timer etter operasjonen. Om nødvendig kan smertestillende gis for å redusere smerte og ubehag.

7. Tissue Processing

Samle electroporated embryoene eller unger ved embryonale eller postnatal stadier kreves for forsøket.

ove_content "> - For analyse på embryonale stadier (for eksempel for å studere cellevekst eller migrasjon):
Avlive moren via cervical forvridning og samle embryoer. Etter halshogging, velger hjernen som er riktig electroporated, som indikert av mengden og plasseringen av fluorescerende signal, visualisert gjennom skallen med en fluorescerende kikkert. Dissekere hjernen ut av skallen og fikse overnatting i 4% PFA og deretter plass i 20% sukrose / PBS over natten. Legge i oktober sammensatte, frys ved -80 ° C og avsnitt ved hjelp av en cryostat.

- For analyse på postnatale stadier (for eksempel for å studere dendritter og pigger):
Anesthetize valper eller voksne mus med intraperitoneal injeksjon av pentobarbitone (40-60 mg / kg) og utføre transcardial perfusjon med PBS, etterfulgt av 4% PFA i PBS. Dissekere hjernen ut av skallen og post-fix i 4% PFA natten. Etter vask i PBS, seksjon hjernen ved hjelp av en vibratome (100 mikrometer seksjoner for dendrite analyse). Monter delene i Aqua Poly / mount bruker 0.16-0.19 mm tykke Dekkglass til image dendritter og pigger.

8. Representative resultater

Figur 3 viser eksempler på electroporated celler i hjernebarken (Tall 3A, B), i CA1 (Tall 3C, D) og i dentate gyrus av hippocampus (Tall 3E, F). Villtype mus ble electroporated på E14.5 med en GFP konstruksjon (PCA-b-EGFPm5 lyddemper 3) og hjerner ble høstet ved postnatal dag (P) 14. Ved å injisere et lite volum av DNA løsning (0,5 mL eller mindre av en løsning på en mikrogram / ​​mL), er noen få celler merket, noe som tillater visualisering av dendrittiske arborization av isolerte GFP + celler (figur 3), samt deres spines ved høyere forstørrelse (figur 4).

Figur 1. Skjematisk fremstilling av electroporation protokoller som kan brukes til å studere dendritter og pigger. (A) electroporation av en GFP konstruere å sammenligne dendritter og pigger i villtype og mutant mus. (B) electroporation av GFP-shRNA (GFP er uttrykt fra samme konstruksjon) for å sammenligne dendritter og pigger i mus electroporated med en shRNA konstruere spesifikk for et gen av interesse (X) eller en kontroll shRNA. (C) IUE kan brukes sammen med en Cre induserbar system for å begrense uttrykk for shRNA til ønskelig tidsperioden. I dette eksperimentet, en vektor som uttrykker en form for Cre recombinase som kan aktiveres ved 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER ^T2 CreER ^T2; 1 mikrogram / ​​mL) ^10, er electroporated sammen med en vektor som uttrykker en bestemt shRNA i en Cre avhengige måte (1 mikrogram / ​​mL, og med en rekombinasjon indikator (CALNL-GFP konstruere, GFP uttrykk induserbar ved Cre;. 1 mikrogram / ​​mL) ¹⁰ efficiency av knockdown kan forbedres ved å øke konsentrasjonen av shRNA samt øke CAG-ER ^T2 CreER ^T2 konsentrasjon.

Figur 2. Romlig kontroll av electroporation. Denne figuren viser hvor du skal plassere padle elektrodene i henhold til DNA injeksjonsstedet for å målrette hjernebarken eller hippocampus.

Figur 3. Visualisering av dendrittiske arbor in utero electroporated cellene i hjernebarken og hippocampus. (A, B) koronale seksjoner viser GFP + pyramidale celler i cerebral cortex, (CD) pyramidale celler i CA1 av hippocampus og (E, F), granule celler i dentate gyrus på P14. En GFP konstruksjon (PCA-b-EGFPm5 lyddemper 3) ble electroporated på E14.5. Høyere forstørrelse bilder (B, D, F) viser at IUE er en effektiv metode for å visualisere dendritter. Skala søylene representerer 50 mikrometer (B, D og F), 150 mikrometer (A, C, E).

Figur 4. Visualisering av dendrittiske spines i P14 nevroner som ble electroporated i utero på E14.5 med en GFP uttrykker konstruere. (A, B) stor forstørrelse bilder av pigger fra basal dendritter av hippocampus pyramidale nevroner. Skala søylene representerer 5 mikrometer (A) og 2 mikrometer (B).

Discussion

IUE er et kraftig verktøy for å manipulere genuttrykket ikke bare i verdensrommet, men også i tid. Vi viser her at denne teknikken kan brukes til å visualisere og genetisk manipulere dendritter og pigger i hjernebarken og hippocampus hos mus. Foruten de fordelene som tidligere sitert, er det verdt å merke seg at IUE, i motsetning til Golgi-metoden, kan kombineres med immunhistokjemi eller in situ hybridisering, som tillater for eksempel å fenotype de electroporated cellene. Det er også viktig å nevne at denne fremgangsmåten ikke induserer åpenbare hjernen misdannelser tross for sin relative invasivitet. I tillegg, på cellenivå, ikke IUE ikke endre elektrofysiologiske egenskaper electroporated nevroner ^13. Mens vår demonstrasjon fokuserer på visualisering av dendrite og ryggrad morfologi, kunne IUE av kortikale eller hippocampus nevroner ved E14.5 også brukes til å studere andre utviklingsforstyrrelser hendelser som axon formasjon og veiledning. I leggeition, samme type protokoll kan gjennomføres ved andre stadier av embryoutvikling å målrette ulike populasjoner. For eksempel kan en utviklingshemmede veldig sent kortikal electroporation paradigmet på E18.5 utføres for å kjøre uttrykk i astrocytic stamfedre ^1. Tilsvarende mens en electroporation av hippocampus ved E14.5 gjør det mulig å målrette CA1-CA3 pyramidale nevroner stamfedre og dentate granule celle progenitor samtidig, ville en sen hippocampus electroporation (E18.5 eller tidlig postnatal) tillate å målrette ulike dentate granule stamfedre ^14. I dette tilfellet kan det injiserte volumet av DNA økes, samt intensiteten i strømmen.

Transgener introdusert av IUE synes å forbli episomal og er derfor tapt fra celler etter rad celledelinger. I postmitotic celler som nerveceller, men de episomal transgener forblir aktive i flere måneder etter electroporation slik langtidsstudier ¹³, 15. I vår studie har vi sett lyse GFP ⁺ celler opp til 7 uker etter fødselen (den nyeste tidspunktet vi analyserte) indikerer at embryonale målretting av kortikale eller hippocampus nevrale forløpere bruker IUE resultater i vedvarende uttrykk for transgene fra tidlige utviklingsforstyrrelser tidspunkter opp til voksenlivet.

En gjeldende begrensning av teknikken er at det er vanskelig å utøve en god kontroll over det totale antall electroporated celler. Men ved å redusere det injiserte volumet av DNA-løsning, har vi vist at det er mulig å merke noen få celler og til å visualisere dendrittiske arborization av isolerte GFP + celler samt deres pigger. Dimensjonen på transfekterte området kan også bli justert ved å endre parametrene av electroporation som intensitet av nåværende og antall pulser eller diameteren på electroporation padleårer.

Tilsammen IUE er en metode som er enkel å implementere, rask ogeffektivt å studere dendritter og ryggrader in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Navn på reagensen	Firma	Katalognummer	Kommentarer
			Utarbeidelse av nåler og DNA injeksjonsvæske
Endofree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Rask Grønn	Sigma	F-7258
Borsilikatglass kapillærer 1,0 mm OD x 0,58 mm ID	Harvard Apparatus	30-0016
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For Eppendorf pipetter 0,5 mL-10 mL / 2-20 mL
		& Nbsp;	Materiale for kirurgi
Ekstra tynne Iris saks	Fin Science Verktøy	14088-10
Buede tang	Fin Science Verktøy	91197-00
Ring tang	Fin Science Verktøy	11103-09
Needle holder	Fin Science Verktøy	12002-12
Graefe tang	Fin Science Verktøy	11050-10
Vicryl absorberbare suturer	Ethicon Inc (Johnson & Johnson)	W9074
Sterile gardiner 30cm x 45 cm	Buster	141765
Sterile kompresser	Shermond	Huby-340
Bomullspinner	Clean Cross Co, Ltd	1860
Buprenorfin (Vetergesic)	Alstoe Animal Health
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
Eye Gel Viscotears	Novartis
Isofluran	Abbott Laboratories	B506
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20%	Animalcare
			Electroporation
Electroporator	BTX	ECM830
Platinum Tweezertrode 5mm	BTX, Harvard Apparatus	45-0489
Femtojet microinjector	Eppendorf	5247000030
Foot Control for Femtojet Microinjector	Eppendorf	5247623002
Kapillær holder	Eppendorf	5176190002
			Tissue behandling
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Sukrose	VWR (Prolabo)	27480.294
Objektglass	ThermoScientific (Menzel-Glaser)	J1800AMNZ
Dekkglass	Menzel-Glaser		22 x 50 mm # 1,5
Aqua Poly / mount	Polysciences, Inc	18606