Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

Summary

Denna artikel beskriver i detalj ett protokoll till elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus vid E14.5 hos möss. Vi visar också att detta är en värdefull metod för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.

Abstract

In utero elektroporering (IUE) har blivit en kraftfull teknik för att studera utvecklingen av olika regioner av den embryonala nervsystemet ^1-5. Hittills detta verktyg allmänt har använts för att studera regleringen av cellulär proliferation, differentiering och neuronal migrering speciellt i utvecklingen av cerebral cortex ^6-8. Här har vi närmare vårt protokoll för att elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus och ge bevis för att detta tillvägagångssätt kan användas för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.

Visualisering och manipulering av neuroner i primära kulturer har bidragit till en bättre förståelse av de processer som är involverade i dendrit, ryggen och synaps utveckling. Men nervceller växer in vitro inte utsätts för alla de fysiologiska signaler som kan påverka Dendrite och / eller ryggrad bildning och underhåll under normal utveckling. Vår kunskap om dendritiska och ryggrad strukturer 9. Dock Golgi färgning vara oförutsägbar. I själva verket grupper av nervceller och skrifter fiber märkt slumpmässigt, med specifika områden ofta visas helt färgade medan intilliggande områden saknar färgning. Nyligen genomförda studier har visat att IUE av fluorescerande konstruktioner representerar en attraktiv alternativ metod för att studera dendriter, ryggar samt synapser i mutanta / vildtyp möss ^10-11 (Figur 1A). Dessutom i jämförelse med generering av mus knockouts representerar IUE en snabb metod för att utföra vinst och förlust av funktion studier i specifik population av celler under en viss tid. Dessutom har IUE framgångsrikt använts med inducerbar genexpression eller inducerbar RNAi närmar att förfina temporal kontroll över uttrycket av en gen eller shRNA ^12. Dessa fördelar har IUE opene sålundad nya dimensioner för att studera effekten av genuttryck / dämpning på dendriter och ryggar inte bara i vissa cerebrala strukturer (Figur 1B), men också vid en viss tidpunkt i utvecklingen (figur 1C).

Slutligen ger IUE ett användbart verktyg för att identifiera funktionella interaktioner mellan gener involverade i dendrit, ryggen och / eller synaps utveckling. I själva verket, till skillnad från andra genöverföringsmetoder såsom virus, är det enkelt att kombinera multipla RNAi eller transgener i samma cellpopulation.

Sammanfattningsvis är IUE en kraftfull metod som redan har bidragit till karakterisering av molekylära mekanismer som ligger bakom hjärnfunktion och sjukdom och den bör också vara användbara vid studium av dendriter och ryggar.

Protocol

I Storbritannien, möss inrymt, uppfödd och behandlas enligt de riktlinjer som godkänts av inrikesministeriet under djuret (vetenskapliga förfaranden) Act 1986.

1. Förberedelser: DNA-lösning och Needles

1. Rena plasmid-DNA med en endotoxinfri Maxi-prep kit. Framställning av plasmid-DNA-lösning för injektion till önskade koncentrationer i vatten och tillsätt Fast Green (slutlig koncentration av 0,05%) för att visualisera injektioner. Effektiviteten av elektroporering är starkt beroende av DNA-koncentrationen. En koncentration av 1 pg / pl i allmänhet används. Denna koncentration är tillräcklig för att visualisera elektroporerade nervceller utan att påverka deras utveckling. Emellertid, enligt den promotor som används i plasmidvektorn (låg expressionsnivå med cytomegalovirus promotor / förstärkare, starkt uttryck i nivå med cytomegalovirusets omedelbara tidiga förstärkare och kyckling β-aktinpromotor-fusion (CAG)-promotor) samt storleken och stabilitet hos det uttryckta proteinet, kan denna koncentration justeras (0,25 | ig / | il till 5 pg / pl).
2. Dra glas nålar med hjälp av en mikropipett avdragare.

2. Framställning av operationen

1. Autoklavera kirurgiska instrument och fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
2. Framställ analgetisk lösning i PBS (buprenorfin, Vetergesic, slutlig koncentration av 30 pg / ml). Väg gravida musen och injicera subkutant 0,1 mg / kg Vetergesic minst 30 minuter före operationen. Under denna tid framställa det kirurgiska området. Slå på värmedynor och återhämtningen kammare. Placera steril PBS i varmt vattenbad och alla sterila instrument och material på sterila dukar. Placera platina elektroder i en PBS fylld bägare och ansluta till elektroporator. Fylla nålen med den DNA-lösningen med användning av en microloader spets, ansluter nålen till det kapillära hållaren och nypa av spetsen på nålen med en kirurgtång.

e_title "> 3. operation före DNA-injektion och Elektroporering

1. Söva en gravid mus (E14.5-E15.5) med isofluran i syre bärare (syre 2 l / min) med hjälp av en narkos induktion kammare. Vänta till dess att djuret förlorar righting reflex.
2. Överföra djuret till ett "för-kirurgi" masken. Placera en droppe Eye Gel på varje öga för att förhindra hornhinnesår av ögonen medan mamman är under narkos. Använd en elektrisk rakapparat att raka håret av buken. Rengör det rakade området en gång med clorhexidine att samla flygande hår.
3. Överföra djuret till en andra mask i det kirurgiska området. Placera musen med ryggen på värmedyna. Starta operation när pedalen reflexen har gått förlorad.
4. Sätt på masken och sterila handskar. Täcka djuret med en steril duk (med ett litet hål över buken) för att förhindra att vävnad och instrument från att kontamineras av de hudområden som inte har rakats och desinficeras. Rengör det rakade området ent åtminstone 3 gånger med clorhexidine. Använd en annan steril bomullspinne varje gång. Använda en skalpell för att göra ett vertikalt snitt längs mittlinjen (~ 1 cm lång) genom huden. Med sax, göra en liknande snitt i muskeln i buken längs linea alba (vit linje som består mestadels av kollagen bindväv).
5. Välj de mest tillgängliga embryon och placera ringen tången mellan två embryon och försiktigt dra embryonala kedjan ut ur bukhålan. Från denna punkt, hålla embryona hydrerad med steril förvärmd PBS.

Ingen mikroskop krävs för visualisering.

4. Injektion av DNA och Elektroporering

1. Börja med en av de mest laterala embryon gör det lättare att hålla reda på vilka embryon elektroporerades. Dra inte för mycket på embryona, eftersom detta ökar risken för blödning. Manipulera läget av embryot inuti fostersäcken med användning av de ring-pincett ochstabilisera huvudet av embryon mellan ringarna. Pressa försiktigt pressa upp embryot närmare livmoderväggen.
2. Med den andra handen, ta kapillär hållaren och stick in nålen försiktigt i mitten av halvklotet att rikta den laterala ventrikeln. Tryck på pedalen för att injicera ca 1 | il DNA-lösning blandades med Fast Green (mindre än 1 | il för att studera dendriter). Du bör observera det gröna färgämnet fylla den laterala ventrikeln. Kritiska steg: - Skärpan av nålen är avgörande att tränga igenom ordentligt livmoderväggen. Det är viktigt att minimera rörelse av nålen vid ytan av livmoderväggen och efter införande i ventrikeln eftersom en förstoring av hålet kommer att resultera i läckage av fostervatten och embryot dör. Undvik fartyg piercing blod i livmoderväggen, eftersom detta kommer att resultera i blödning och embryo död.
   - Det är viktigt att inte injicera en alltför stor volym av DNA in i den laterala ventrikeln eftersom det kommer att inducerahydrocefalus (inte överstiger 2 pl kl E14.5). Volymen av DNA-justeras i enlighet med syftet av experimentet. Om 1 | il används i allmänhet för de flesta experiment, är en mindre volym av DNA (cirka 0,5 | il) som krävs för dendritbildning och ryggrad analys. I själva verket några isolerade celler behöver riktas för att visualisera och mäta dendritiska bersån på elektroporerade nervceller.
3. Placera elektroderna på sidorna av embryot huvudet med den positiva (+) paddla på samma sida som den injicerade kammaren för cortex elektroporering eller på motsatt sida av den injicerade kammaren för Hippocampus elektroporering (Figur 2). Applicera sedan fem 30V elektriska pulser (50 msek varaktighet) vid 1 sek intervall. Avgörande steg: Undvik att ström över placenta eftersom detta kommer att resultera i embryo döden.
   Alla embryona i en gravid mus kan elektroporeras, vanligtvis med samma DNA-konstruktionen för att undvika förvirring. Men en lång operation minskning är det för överlevnaden av embryon. Bukhålan bör inte öppnas längre än 30 minuter.

5. Kirurgi efter elektroporering

1. Efter elektroporera embryona, lägg PBS i bukhålan och använda ringen pincett för att ersätta livmoderhornet på sin ursprungliga plats. Suturera bukväggen och hud med Vicryl absorberbara suturer.
2. Placera djuret i en återvinningskammare tills den aktiveras (vanligen 5-10 minuter) och sedan överföra i en bur placeras på en värmedyna.

6. Efter operation

Kontrollera mössens beteende för att bedöma smärta, lidande eller ångest och väga djuren 24 h och 48 timmar efter operationen. Vid behov kan analgetika administreras för att minimera smärta och obehag.

7. Tissue Processing

Samla elektroporerade embryona eller ungarna vid embryonala eller postnatal steg som krävs för försöket.

ove_content "> - För analys vid embryonala stadier (t ex för att studera cellproliferation och migration):
Euthanize mamma via cervikal dislokation och samla embryona. Efter halshuggning, välj hjärnor som fått adekvat elektroporerade, vilket indikeras av mängden och placeringen av den fluorescerande signalen, visualiseras hela skallen med en fluorescerande kikare. Dissekera hjärnan ur skallen och fixa övernattning i 4% PFA och sedan i 20% sackaros / PBS över natten. Bäddas in i OCT-förening, frys vid -80 ° C och sektionen med användning av en kryostat.

- För analys vid postnatal steg (t ex för att studera dendriter och ryggar):
Bedöva avkomman eller vuxna möss med intraperitoneal injektion av pentobarbiton (40-60 mg / kg) och utför transkardiell perfusion med PBS, följt av 4% PFA i PBS. Dissekera hjärnan ur skallen och efter-fix i 4% PFA natten. Efter tvättningar i PBS, avsnitt hjärnorna med en vibratom (100 pm sektioner för dendrite analys). Montera sektionerna i Aqua Poly / fäste med 0.16-0.19 mm tjocka täckglas att bilden dendriter och ryggar.

8. Representativa resultat

Figur 3 visar exempel på elektroporerade cellerna i hjärnbarken (figurerna 3A, B), i CA1 (figurerna 3C, D) och i dentate gyrus i hippocampus (figurerna 3E, F). Vildtypsmöss elektroporerades vid E14.5 med en GFP-konstrukt (pCA-b-EGFPm5 ljuddämpare 3) och hjärnorna skördades vid postnatal dag (P) 14. Genom att injicera en liten volym DNA-lösning (0,5 | il eller mindre av en lösning vid 1 pg / pl), är ett fåtal celler märkta, vilket möjliggör visualisering av den dendritiska förgrening av isolerade GFP + celler (figur 3), såväl som deras ryggar vid högre förstoring (Figur 4).

Figur 1. Schematisk representation av elektroporation protokoll som kan användas för att studera dendriter och ryggar. (A) Elektroporering av en GFP-konstruktionen för att jämföra dendriter och ryggar i vildtyp-och mutant-möss. (B) Elektroporering av GFP-shRNA (GFP uttrycks från samma konstruktion) för att jämföra dendriter och ryggar i möss elektroporerade med en shRNA konstruera specifika för en gen av intresse (X) eller en kontroll shRNA. (C) IUE kan användas tillsammans med en Cre inducerbara systemet för att begränsa uttryck av shRNA till önskvärd tidsperiod. I detta experiment en vektor som uttrycker en form av Cre-rekombinas, som kan aktiveras av 4-hydroxitamoxifen (CAG-ER ^T2 Creer ^T2; 1 pg / pl) ^10, elektroporeras tillsammans med en vektor som uttrycker en specifik shRNA i en Cre-beroende sätt (1 pg / pl och med en rekombination indikator (CALNL-GFP-konstruktionen, GFP-uttryck induceras genom Cre;. 1 pg / pl) ¹⁰ verkningsgradency av knockdown kan förbättras genom att öka koncentrationen av den shRNA samt öka CAG-ER ^T2 Creer ^T2 koncentration.

Figur 2. Spatial kontroll av elektroporering. Denna siffra visar var att placera paddla elektroderna enligt DNA injektionsstället för att rikta hjärnbarken eller hippocampus.

Figur 3. Visualisering av den dendritiska spindeln in utero elektroporerades celler i hjärnbarken och hippocampus. (A, B) Koronala sektioner som visar GFP + pyramidala celler i hjärnbarken, (CD) pyramidala celler i CA1 av hippocampus och (E, F), granulceller i gyrus dentatus i P14. En GFP konstruktion (PCA-b-EGFPm5 ljuddämpare 3) elektroporerades vid E14.5. Högre förstoring bilder (B, D, F) visar att IUE är en effektiv metod för att visualisera dendriter. Skalstrecken representerar 50 pm (B, D och F), 150 ^ m (A, C, E).

Figur 4. Visualisering av Dendritutskotten i P14 nervceller som elektroporerades i livmodern vid E14.5 med GFP-uttryckande konstruktion. (A, B) med hög förstoring bilder av ryggrader från basala dendriter hippocampala pyramidala neuroner. Skalstrecken representerar 5 pm (A) och 2 ^ m (B).

Discussion

IUE är ett kraftfullt verktyg för att manipulera genexpression inte bara i rummet utan även med tiden. Vi visar här att denna teknik kan användas för att visualisera och genetiskt manipulera dendriter och ryggar i hjärnbarken och hippocampus hos möss. Förutom de fördelar som tidigare nämnda, är det värt att notera att IUE, i motsats till Golgi-metoden, kan kombineras med immunohistokemi eller hybridisering in situ, vilket tillåter exempelvis att fenotyp de elektroporerade cellerna. Det är också viktigt att nämna att detta förfarande inte inducerar tydliga hjärnan missbildningar trots sin relativa invasivitet. Dessutom, på cellnivå, ändrar IUE inte de elektrofysiologiska egenskaperna hos de elektroporerade neuroner ^13. Även om vår demonstration fokuserar på visualisering av dendritiska och ryggrad morfologier kunde IUE av kortikala eller hippocampus neuroner vid E14.5 också användas för att studera andra utvecklingsstörningar händelser såsom axon formation och vägledning. I Lägg tillition, samma typ av protokoll kan genomföras på andra stadier av embryonal utveckling för att rikta olika populationer. Till exempel kan en utvecklingsmässigt mycket sent kortikala elektroporering paradigmen vid E18.5 utföras för att driva expression i astrocytiska progenitorer ^1. Liknande sätt, medan en elektroporation av hippocampus vid E14.5 tillåter att rikta CA1-CA3 pyramidala neuroner progenitorer och gyrus granul-cell ursprungsceller samtidigt, skulle en sen hippocampus elektroporering (E18.5 eller tidiga postnatala) tillåter att rikta olika gyrus granul stamfäder ^14. I detta fall kan den injicerade volymen av DNA ökas såväl som intensiteten hos strömmen.

Transgener införs genom IUE verkar vara episomala och därför förlorade från celler på varandra följande celldelningar. I postmitotiska celler såsom neuron dock de episomala transgenerna förblir aktiva under flera månader efter elektroporering möjliggör långtidsstudier ¹³, 15. I vår studie har vi observerat ljusa GFP ⁺ celler upp till 7 veckor efter födseln (den senaste tidpunkt vi analyserat) pekar på att embryonal inriktning på kortikala och hippocampus neuronala prekursorer med IUE orsakar bestående uttryck av transgenen från tidiga utvecklingsstadier tidpunkter upp till vuxen ålder.

En ström begränsning av denna teknik är att det är svårt att utöva en exakt kontroll över det totala antalet elektroporerade celler. Emellertid, genom att minska den injicerade volymen av DNA-lösning, har vi visat att det är möjligt att märka ett fåtal celler och att visualisera den dendritiska förgrening av isolerade GFP + celler, såväl som deras ryggar. Dimensionen för den transfekterade området skulle också kunna justeras genom att modifiera parametrarna i elektroporering såsom intensiteten hos strömmen och antalet pulser eller diametern hos de elektroporation paddlar.

Sammantaget IUE är en metod som är enkel att implementera, snabb ocheffektiv för att studera dendriter och ryggar in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namnet på reagens	Företaget	Katalognummer	Kommentarer
			Beredning av nålar och DNA-lösning för injektion
Endofree Plasmid Maxi kit	Qiagen	12.362
Fast Green	Sigma	F-7258
Borsilikatglas kapillärer 1,0 mm ytterdiameter x 0,58 mm ID	Harvard Apparatus	30-0016
Microloader spetsar	Eppendorf	5242956003	För Eppendorf pipetter 0,5 pl-10 ul / 2-20 ul
		& Nbsp;	Material för kirurgi
Extra tunna Iris sax	Fina Science Tools	14.088-10
Böjda Tång	Fina Science Tools	91.197-00
Ring pincett	Fina Science Tools	11.103-09
Nålhållaren	Fina Science Tools	12.002-12
Graefe Tång	Fina Science Tools	11.050-10
Vicryl resorberbara sutur	Ethicon Inc. (Johnson & Johnson)	W9074
Sterila dukar 30cm x 45 cm	Buster	141.765
Sterila kompresser	Shermond	Huby-340
Bomullspinnar	Clean Cross Co, Ltd	1860
Buprenorfin (Vetergesic)	Alstoe Animal Health
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
Ögongel Viscotears	Novartis
Isofluran	Abbott Laboratories	B506
Pentoject, pentobarbitonnatrium 20%	Animalcare
			Elektroporering
Elektroporator	BTX	ECM830
Platina Tweezertrode 5mm	BTX, Harvard Apparatus	45-0489
Femtojet mikroinjektor	Eppendorf	5247000030
Fot Control för Femtojet mikroinjektor	Eppendorf	5247623002
Kapillärhållare	Eppendorf	5176190002
			Tissue bearbetning
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Sackaros	VWR (Prolabo)	27480.294
Mikroskopobjektglas	ThermoScientific (Menzel-Glaser)	J1800AMNZ
Täckglasen	Menzel-Glaser		22 x 50 mm # 1,5
Aqua Poly / mount	Polysciences, Inc.	18.606