Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Summary

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Abstract

Utero elektroporasyon yılında (İEÜ) Embriyonik sinir sisteminden ^1-5 farklı yörelerin kalkınmasına çalışmak için güçlü bir tekniği haline gelmiştir. Bu araç yaygın olarak hücresel çoğalma, farklılaşma ve özellikle gelişmekte olan serebral korteks ^6-8 nöronal göçün düzenlenmesi incelemek için kullanılır olmuştur bugüne kadar. Burada detaylı bizim protokol utero serebral korteks ve hipokampus electroporate ve bu yaklaşımı, bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir kanıt sağlamak.

Primer kültürlerinde nöronların Görselleştirme ve manipülasyon dendrit, omurga ve sinaps geliştirilmesinde rol süreçlerin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak in vitro büyüyen nöronların normal gelişim sırasında dendrit ve / veya omurga oluşumu ve bakım etkileyebilecek tüm fizyolojik ipuçları maruz değildir. Dendrit ve omurga yapıları bilgilerimiz 9 gözlemler, çoğunlukla gelir. Bununla birlikte, Golgi boyama öngörülemeyen olarak kabul edilir. Gerçekten de, sinir hücreleri ve lif yolları grupları bitişik alanları boyama yoksun ise belirli alanlarda genellikle tamamen lekeli görünmesi ile, rastgele etiketlenir. Son çalışmalar floresan yapıları İEÜ mutant / wild-tip farelerden ^10-11 (Şekil 1A) olarak dendrit dikenler gibi sinaps çalışmak için cazip bir alternatif yöntem temsil ettiğini göstermiştir. Dahası fare Knockouts üretimi ile karşılaştırıldığında, IUE belirli bir zaman süresince penceresi hücrelerin spesifik popülasyonda fonksiyonu çalışmaların kazanç-kayıp gerçekleştirmek için hızlı bir yaklaşımı temsil eder. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde IUE RNAi bir gen ya da shRNA ¹² ifadesi üzerindeki zamansal kontrolü rafine yaklaşır indüklenebilen gen ekspresyonu ya indüklenebilen ile birlikte kullanılmıştır. İEÜ Bu avantajları dolayısıyla opene vard yeni boyutları sadece belirli beyin yapıları (Şekil 1B) değil, aynı zamanda gelişimi belirli bir zaman noktasında (Şekil 1C) olarak dendrit ve dikenler üzerinde gen ekspresyonu / bastırma etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.

Son olarak, İEÜ dendrit, omurga ve / veya sinaps geliştirme ilgili genler arasında işlevsel etkileşimleri belirlemek için yararlı bir araç sağlar. Gerçekten de, bu tür virüsler gibi diğer yöntemler gen aktarımı aksine, bu hücrelerin, aynı popülasyon içinde birden çok RNAi ya transgenlerin birleştirmek için açıktır.

Özet olarak, zaten IUE beyin fonksiyonu ve hastalık moleküler mekanizmaları karakterizasyonu katkıda bulunan ve aynı zamanda dendritler ve omurga çalışması ve yardımcı olacaktır güçlü bir yöntemdir.

Protocol

Birleşik Krallık'ta, fareler, ev sahipliği yetiştirilen ve Hayvan (Scientific Procedures) Act 1986 kapsamında İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan yönergelere göre tedavi edilir.

1. Hazırlanışı: DNA Çözüm ve İğneler

1. Bir Endotoksin ücretsiz Maxi hazırlık kiti ile plazmid DNA arındırın. Suda istenilen konsantrasyonda enjeksiyon için plazmid DNA çözeltisi hazırlayın ve enjeksiyonlar görselleştirmek için (% 0.05 final konsantrasyon) Fast Green ekleyin. Elektroporasyon verim DNA konsantrasyonu çok bağımlı olduğunu. 1 ug / ml arasında bir konsantrasyonda, genellikle kullanılır. Bu konsantrasyon onların gelişimini etkilemeden electroporated nöronlar görselleştirmek için yeterlidir. Bununla birlikte, plazmid vektörü olarak boyutu ve (sitomegalovirüs hızlandıncı / kuvvetlendirici, sitomegalovirüs acil erken geliştirici ve tavuk β-aktin promotör fusion (CAG) promotörü ile güçlü bir ifade ile düşük düzey ifade seviyesini) 'de kullanılan promotör göre ifade edilen protein stabilitesi, bu konsantrasyon (0,25 ug / ml ila 5 ug / ul) ayarlanabilir.
2. Mikropipet çektirmenin kullanılarak cam iğneler çekin.

2. Cerrahi hazırlanması

1. Cerrahi aletler ve fosfat tamponu (PBS) otoklavlayın.
2. PBS (Buprenorfin, 30 ug / ml 'lik Vetergesic, son konsantrasyon) analjezik çözeltisi hazırlayın. Gebe fare tartılır ve en az 30 dakika ameliyattan önce Vetergesic deri altına 0.1 mg / kg enjekte. Bu süre boyunca, cerrahi alanı hazırlamak. Isıtma pedleri ve kurtarma odası açın. Sıcak su banyosu ve steril örtüler tüm steril alet ve malzemelerin steril PBS yerleştirin. PBS dolu behere platin elektrot yerleştirin ve elektroporatörün bağlanın. Bir Microloader ucunu kullanarak DNA solüsyonu ile iğne doldurun, kılcal sahibine iğne bağlamak ve bir forseps ile iğne ucu çimdiklemek.

DNA Enjeksiyon ve Elektroporasyon önce E_TITLE "> 3. Cerrahi

1. Bir indüksiyon odalarını kullanarak (oksijen 2 lt / dk) oksijen taşıyıcı izofluran ile hamile bir fare (E14.5-E15.5) uyuşturan. Hayvan refleks doğrulma kaybeder kadar bekleyin.
2. Bir "ön-cerrahi" maskesi hayvan aktarın. Annenin genel anestezi altında iken gözler kornea ülseri önlemek için her göze göz jeli bir damla yerleştirin. Karın tıraş etmek için bir elektrik ustura kullanın. Uçan saç toplamak için clorhexidine ile bir kez traş alanı temizleyin.
3. Cerrahi alanında ikinci bir maske için hayvan aktarın. Isıtma yastığı sırtını ile fare yerleştirin. Pedal refleks kesildi cerrahi başlayın.
4. Maske ve steril eldiven giyin. Tıraş ve dezenfekte edilmemiş deri alanları ile kontamine olmaktan doku ve araçların önlemek için steril bir drape (karın üzerinde küçük bir delik ile) ile hayvan örtün. Bir traş alanı temizleyinen t clorhexidine ile 3 kez. Farklı bir steril pamuklu çubukla her zaman kullanın. Deri yoluyla orta hat (~ 1 inç uzunluğunda) boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Makas kullanarak, linea alba (beyaz çizgi kollajen bağ dokusu çoğunlukla oluşan) boyunca karın kaslarının benzer bir kesi yapmak.
5. En erişilebilir embriyolar seçin ve iki embriyo arasında halka forseps yerleştirin ve dikkatlice karın boşluğu dışında embriyonik zinciri çekin. Bu noktadan itibaren, steril önceden ısıtılmış PBS ile embriyolar nemli tutar.

No mikroskop görüntülenmesi için gereklidir.

4. DNA ve Elektroporasyon Enjeksiyon

1. Daha kolay embriyolar electroporated edildiği izlemek için yapım, en lateral embriyoların biriyle başlayın. Bu kanama riskini artıracak gibi embriyo üzerinde çok fazla çekmeyin. Halka ve forseps kullanılarak amniyon kesesi içinde embriyonun konumu manipülehalkaları arasındaki embriyoların başı sabitlemek. Embriyo yakın rahim duvarına kadar itmek hafifçe sıkın.
2. Diğer elinizle kılcal tutucu almak ve lateral ventrikül hedef yarımkürenin orta dikkatlice iğneyi. Fast Green (dendritler okumaya az 1 ul) ile karışık DNA solüsyonu yaklaşık 1 mikrolitre enjekte etmek için pedal basın. Sen lateral ventrikül dolum yeşil boya gözetmelidir. Kritik adımlar: - iğne keskinliğini düzgün rahim duvarı delmek için çok önemlidir. Delikli bir genişleme amniyotik sıvı ve embriyo ölüm sızıntı neden olacaktır çünkü uterus duvar yüzeyinde ve ventrikül içine yerleştirildikten sonra iğne hareketi en aza indirmek için önemlidir. Bu kanama ve embriyo ölüme neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarları kaçının.
   - Bu neden olacaktır çünkü lateral ventrikül içine DNA bir çok büyük hacimli enjeksiyon için önemli değildirhidrosefali (E14.5 az 2 ul aşmayın). DNA'yı hacminin deney amacına göre ayarlanır. 1μl, genellikle en deneyler için kullanıldığı takdirde, DNA (yaklaşık 0.5 ul) daha küçük bir hacim dendrit ve omurga analizi için gereklidir. Gerçekten de birkaç izole hücrelerin electroporated nöronların dendritik çardak görselleştirmek ve ölçmek için hedef gerekir.
3. Korteks elektroporasyon için enjekte ventrikül olarak veya hipokampus elektroporasyon için enjekte ventrikül (Şekil 2) karşı tarafta aynı tarafta pozitif (+) raket ile embriyonun baş tarafında elektrotlar yerleştirin. Daha sonra 1 sn aralıklarla beş 30V elektrik darbeleri (50 msn süreli) uygulanır. Kritik adım: Bu embriyo ölüme neden olacak gibi plasenta arasında geçerli uygulamaktan kaçının.
   Hamile bir farenin tüm embriyolar herhangi bir karışıklığı önlemek için inşa genellikle aynı DNA ile, electroporated edilebilir. Bununla birlikte, uzun bir cerrahi azalma embriyoların hayatta kalma oranı nedir. Karın boşluğuna 30 dakika daha uzun açılmamalıdır.

5.. Cerrahi sonrası elektroporasyon

1. Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna PBS ekleyin ve özgün konumunda uterin horn yerine halka forseps kullanabilir. Vicryl emilebilir dikişlerle karın duvarı ve cilt dikin.
2. Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilen bir kafese aktarabilir sonra uyanır (genellikle 5-10 dk) ve kadar bir kurtarma odasında hayvan yerleştirin.

6. Post-cerrahi

Ağrı, acı veya sıkıntı değerlendirmek ve cerrahi sonrası hayvanların 24 saat ve 48 saat tartmak farelerin davranışlarını kontrol edin. Gerekirse, analjezikler ağrı ve rahatsızlığı azaltmak için uygulanabilir.

7. Doku İşleme

Deney için gerekli embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında electroporated embriyo veya yavrular toplayın.

ove_content "> - embriyonik aşamalarında (örneğin hücre çoğalması veya göç çalışma) de analiz için:
Servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve embriyolar toplamak. Baş kesilerek, düzgün bir şekilde electroporated edilmiştir beyinleri seçmek gibi floresan sinyal miktarını ve konum ile belirtilen, bir floresan binoküler kullanılarak kafatası boyunca görüntülenmiştir. Kafatası beyin dışarı inceleyin ve% 20 sakkaroz / gece PBS içinde% 4 PFA gecede düzeltmek ve tekrar yerine. ° C ve bölüm kriyostat kullanarak -80 OKT bileşik, dondurucuda Embed.

- Doğum sonrası aşamalarında (örneğin dendrit ve dikenler incelemek için) de analiz için:
Pentobarbitone intraperitoneal (40-60 mg / kg) ile yavru veya yetişkin farelerin uyuşturmak ve PBS içinde% 4 PFA takiben PBS ile transcardial perfüzyon, gerçekleştirebilir. % 4 PFA gece içinde kafatası ve post-düzeltmenin beynini parçalara ayır. Bir vibratome (d için 100 mikron bölümlerini kullanarak PBS, bölüm beyinleri yıkamadan sonraendrite analizi). Görüntü dendrit ve dikene 0.16-0.19 mm kalınlığında lamelleri kullanarak Aqua Poly / mount bölümler monte edin.

8. Temsilcisi sonuçları

Şekil 3 CA1 (Şekil 3C, D) ve hipokampus (Şekiller 3E, F) dentat gyrus'ta serebral kortekse (Şekil 3A, B) 'de electroporated hücrelerinin örnekleri gösterilmektedir. Wild-tip fareler GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) ve beyinleri postnatal gün (P) 14 hasat edildi ile E14.5 az electroporated edildi. DNA solüsyonu bir küçük hacimli (1 ug / ml bir çözeltiden 0.5 ul veya daha az) enjekte edilerek, bir kaç hücreleri izole GFP + hücreleri (Şekil 3) ve aynı zamanda bunların omurga dendritik arborization görselleştirilmesi olanak sağlayan, etiketli yüksek büyütmede (Şekil 4).

Şekil 1. dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir elektroporasyon protokolleri şematik. (A) bir GFP arasında Elektroporasyon vahşi tip ve mutant farelerde dendritler, omurilikteki karşılaştırmak için yapı. (B) GFP-shRNA (GFP aynı yapı ile ifade edilir) ve Elektroporasyon oluşturmak dendritler ve bir shRNA ile electroporated farelerde omurga karşılaştırmak için bir ilgi genindeki (X) ya da bir kontrol shRNA için spesifik. (C) IUE arzu edilir bir süre için shRNA ifade kısıtlamak için bir Kre indüklenebilen sistemi ile birlikte kullanılabilir. Bu deneyde, bir vektör 4-hydroxytamoxifen ile aktive edilebilir Kre rekombinazı bir biçimi ifade (CAG-ER ^T2 CreER ^T2; 1 ug / ul) ^10, bir Kre bağlı olarak, belirli bir shRNA eksprese eden bir vektör ile birlikte electroporated edilir şekilde (1 mcg / ml ve rekombinasyon göstergesi (Kre tarafından CALNL-GFP yapı, GFP indüklenebilir ile;. 1 mcg / ml) ¹⁰ Verimdevirme ve cy shRNA konsantrasyonu artırmanın yanında CAG-ER ^T2 CreER ^T2 konsantrasyonu artırarak geliştirilebilir.

Şekil 2. Elektroporasyon Mekansal kontrolü. Bu şekil serebral korteksteki veya hipokampus hedeflemek için DNA enjeksiyon göre paddle elektrotlar konumlandırmak için burada gösterir.

Şekil 3. Utero ve dendritik çardak Görselleştirme serebral korteks ve hipokampus hücrelerinin electroporated. (A, B) GFP + serebral korteksteki piramidal hücre, (CD) piramidal hipokampusun CA1 hücreleri ve (E, F), P14 azından dentat gyrus'ta granül hücreleri gösteren koronalde. Bir GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) E14.5 de electroporated edildi. Yüksek büyütme resimleri (B, D, F) İEÜ dendritler görselleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 50 mikron (B, D ve F), 150 mikron (A, C, E) temsil eder.

Şekil 4. Inşa ifade eden bir GFP E14.5 az utero electroporated edildi P14 nöronlar dendritik dikenler Görselleştirilmesi. (A, B) hipokampal piramidal nöronların bazal dendritler gelen dikenlerin Yüksek büyütme görüntüler. Ölçek çubukları 5 um (A) ve 2 um (B) temsil eder.

Discussion

İEÜ uzayda değil, zaman sadece gen ekspresyonu işlemek için güçlü bir araçtır. Biz bu tekniğin serebral korteks ve farelerin hipokampus dendrit ve dikenleri görselleştirmek ve genetik işlemek için kullanılabileceğini burada göstermektedir. Daha önce anılan avantajları yanında, İEÜ, yöntem Golgi aksine, immünhistokimya ile veya fenotip electroporated hücreleri örneğin sağlar situ hibridizasyon, kombine edilebilir dikkati çekiyor. Bu prosedür göreceli invaziv rağmen belirgin beyin anormallikleri neden olmadığını belirtmeyi de önemlidir. Buna ek olarak, hücresel seviyede, IUE electroporated nöronların ¹³ elektrofizyolojik özelliklerini değiştirmek değildir. Bizim gösteri dendrit ve omurga morfolojilerinin görselleştirme odaklanırken, E14.5 kortikal veya hipokampal nöronların İEÜ ayrıca akson oluşumu ve rehberlik gibi diğer gelişimsel olayları incelemek için kullanılabilir. Ekleyinition, protokol aynı tür farklı toplumlarda hedef embriyonik gelişimin diğer aşamalarında uygulanabilir. Örneğin, E18.5 bir developmentally çok geç kortikal elektroporasyon paradigma astrositik progenitörlerin ¹ ifade sürmek için gerçekleştirilebilir. E14.5 de hipokampus bir elektroporasyon aynı zamanda CA1-CA3 piramidal nöron ataları ve dentat granül hücre progenitör hedef sağlar Benzer şekilde, bir geç hipokampal elektroporasyon (E18.5 veya erken doğum sonrası) farklı dentat granül hedef için izin verecek progenitörlerin ^14. Bu durumda, DNA enjekte hacmi akım yoğunluğu yanı sıra arttırılabilir.

İEÜ tarafından tanıtıldı transgenlerin epizomal kalması görünür ve bu nedenle ardışık hücre bölünmeleri takip hücrelerinden kaybolur. Bu nöronların olarak postmitotik hücreleri ise, epizomal transgenlerin uzun vadeli çalışma ¹³ izin elektroporasyon sonra ay için aktif kalması, 15. Bizim çalışmamızda, erken gelişimsel zaman noktalarından transgen ısrarla ifade İEÜ sonuçlarını kullanarak kortikal ve hipokampal nöron öncüleri hedefleme embriyonik belirten doğumdan sonra 7 hafta (biz analiz en son saat noktası) parlak GFP ⁺ hücreler kadar gözlemledim yetişkinliğe.

Tekniğin bir akım sınırlama electroporated hücrelerin sayısı üzerinde ince bir kontrol uygulamak zor olmasıdır. Ancak DNA solüsyonu enjekte hacmi azaldığı için, bunun birkaç hücre etiketlemek ve izole GFP + hücrelerin yanı sıra dikenler dendritik arborization görselleştirmek mümkün olduğunu göstermiştir. Transfekte alan boyutu ve aynı zamanda, mevcut darbelerinin sayısı ya elektroporasyon kolları çapı yoğunluğu olarak elektroporasyon parametreleri değiştirerek ayarlanabilir.

Toplamda İEÜ, uygulanması kolay hızlı bir yöntem vein vivo olarak dendrit ve dikenler incelemek için verimli.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
			Enjeksiyon iğneleri ve DNA çözeltisinin hazırlanması
Endofree Plazmid Maxi Seti	Qiagen	12362
Fast Green	Sigma	F-7258
Borosilikat cam kılcal 1.0 mm OD x 0,58 mm ID	Harvard Apparatus	30-0016
Microloader ipuçları	Eppendorf	5242956003	Eppendorf 0.5 ul-10 ul / 2-20 ul pipetler için
		& Nbsp;	Cerrahi için Malzeme
Ekstra ince Iris makas	Güzel Bilim Araçları	14088-10
Kavisli Forseps	Güzel Bilim Araçları	91197-00
Halka forseps	Güzel Bilim Araçları	11103-09
İğne tutucu	Güzel Bilim Araçları	12002-12
Graefe Forseps	Güzel Bilim Araçları	11050-10
Vicryl emilebilir sütür	Ethicon Inc (Johnson & Johnson)	W9074
Steril örtüler 30cm x 45 cm	Buster	141765
Steril bezlerden	Shermond	Huby-340
Pamuk tomurcukları	Temiz Çapraz Co, Ltd	1860
Buprenorfin (Vetergesic)	Alstoe Hayvan Sağlığı
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
Göz jeli Viscotears	Novartis
Izofluran	Abbott Laboratories	B506
Pentoject, Pentobarbitone Sodyum% 20	Animalcare
			Elektroporasyon
Elektroporatör	BTX	ECM830
Platin Tweezertrode-5mm	BTX, Harvard Apparatus	45-0489
FemtoJet mikroenjektör	Eppendorf	5247000030
FemtoJet mikroenjektör için ayak Kontrolü	Eppendorf	5247623002
Kılcal tutucu	Eppendorf	5176190002
			Doku işleme
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Sakaroz	VWR (Prolabo)	27480.294
Mikroskop slaytlar	ThermoScientific (Menzel-Gläser)	J1800AMNZ
Lameller	Menzel-Gläser		22 x 50 mm # 1,5
Aqua Poly / montaj	Polysciences, Inc	18606