الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Palmitoylation هو تعديل المادة الدهنية في مرحلة ما بعد متعدية ينطوي على إلحاق حمض الكربون 16-الدهنية المشبعة، بالميتات، إلى بقايا السيستين من البروتينات الركيزة من خلال السندات thioester عطوب [مشاركة في ^1]. Palmitoylation من البروتين يزيد hydrophobicity الركيزة لها، ويسهل عادة الاتجار تجاه الأغشية الخلوية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة palmitoylation ليكون واحدا من التعديلات الدهون الأكثر شيوعا في الخلايا العصبية ^{1، 2،} مما يدل على أن معدل دوران بالميتات هو آلية هامة من هذه الخلايا التي تنظم الاتجار واستهداف البروتينات. يمكن تحديد والكشف عن ركائز palmitoylated تحسين فهمنا لذلك الاتجار البروتين في الخلايا العصبية.

وقد تم الكشف عن بروتين palmitoylation أعاقت في الماضي من الناحية الفنية نظرا لعدم وجود توافق في الآراء بين تسلسل بروتينات الركيزة، والاعتماد على الأيض labeliنانوغرام من بالميتويل-البروتينات مع ³ H-بالميتات، ومقايسة البيوكيميائية تستغرق وقتا طويلا مع انخفاض الحساسية. تطوير فحص الأسيل، البيوتين (ABE) تبادل تمكن أكثر سرعة وحساسية عالية الكشف البروتينات palmitoylated ^2-4، وهو الأمثل لقياس دوران ديناميكية بالميتات على البروتينات العصبية. وتتألف الفحص ABE من ثلاث خطوات البيوكيميائية (الشكل 1): 1) الحصار لا رجعة فيه معدلة المجموعات ثيول السيستين باستخدام N-ethylmaliemide (NEM)، 2) الانقسام محددة وإماطة اللثام عن مجموعة السيستين palmitoylated في ثيول من هيدروكسيل (HAM)، و 3) وضع العلامات الانتقائي للالسيستين palmitoylated باستخدام كاشف biotinylation ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC. تنقية البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثيول-باتباع الخطوات ABE واختلف، وهذا يتوقف على الهدف العام المتمثل في التجربة.

هنا، نحن تصف طريقة لتنقية بروتين palmitoylated الاهتمام الأساسي hippocampالخلايا العصبية من قبل شركة مناعي الأولية (IP) الخاص خطوة جسم مضاد ضد البروتين، يليه فحص ABE والغربية النشاف لقياس مستويات palmitoylation مباشرة من هذا البروتين، الذي يسمى الفحص IP-ABE. تم منخفض الكثافة الثقافات من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الترجمة، وظيفة، والاتجار بها البروتينات العصبية، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة الخلايا العصبية باستخدام البروتين palmitoylation الفحص IP-ABE. الفحص IP-ABE يتطلب أساسا IP القياسية والكواشف الغربية النشاف، ويقتصر فقط من قبل توافر أجسام مضادة ضد الركيزة الهدف. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا الفحص للكشف عن وتنقية البروتينات palmitoylated بالنقل في مزارع الخلايا مغاير والثقافات العصبية الأولية المستمدة من مختلف أنسجة المخ كل من الماوس والفئران، وحتى الابتدائية أنسجة المخ نفسها.