Detektering av protein palmitoylering i odlade hippocampus neuroner genom immunprecipitation och Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylering är en posttranslationell modifiering lipid inbegriper fastsättning av en mättad 16-kol fettsyra, palmitat, till cysteinrester av substratproteiner genom en labil tioesterbindning [granskas ^1]. Palmitoylering av ett substrat protein ökar hydrofobicitet, och typiskt underlättar dess handel mot cellmembran. Nyligen genomförda studier har visat palmitoylering är en av de vanligaste lipid ändringar i nervceller ^{1, 2,} vilket tyder på att palmitat omsättningen är en viktig mekanism genom vilken dessa celler reglerar inriktning och handel med proteiner. Identifieringen och detektion av palmitoylerade substrat kan därför bättre vår förståelse av protein handel med nervceller.

Detektion av protein palmitoylering tidigare har tekniskt hindrat på grund av avsaknaden av en konsensussekvens bland substratproteiner och beroendet av metabola labeling av palmitoyl-proteiner med ³ H-palmitat, en tidskrävande biokemisk analys med låg känslighet. Utveckling av acyl-Biotin Exchange (ABE) analys möjliggör snabbare och hög känslighet detektering av palmitoylerade proteiner ^2-4, och är optimalt för att mäta dynamiska omsättning palmitat på neuronala proteiner. ABE-analysen består av tre biokemiska steg (Figur 1): 1) irreversibel blockad av omodifierade grupper cysteintiolgrupper med N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifika klyvningen och avslöjande av palmitoylerad cystein är tiolgrupp av hydroxylamin (HAM), och 3) selektiv märkning av palmitoylerad cystein med en tiol-reaktiv biotinyleringsreagens, biotin-BMCC. Rening av tiol-biotinylerade proteiner efter de ABE steg har varit olika, beroende på det övergripande målet för försöket.

Här beskriver vi en metod för att rena en palmitoylerad protein av intresse i primär hippocampal neuroner från en initial immunoutfällning (IP) steg med användning av en antikropp riktad mot proteinet, följt av ABE analysen och western blotting för att direkt mäta palmitoylering nivåer av detta protein, som kallas IP-ABE analys. Low-density kulturer av embryonala råtta hippocampus nervceller har i stor utsträckning använts för att studera lokalisering, funktion och smuggling av neuronala proteiner, vilket gör dem idealiska för att studera neuronal protein palmitoylering med IP-ABE analys. IP-ABE analys kräver huvudsakligen vanlig IP och Western Blotting reagens, och begränsas endast av tillgängligheten av antikroppar mot målsubstratet. Denna analys kan enkelt anpassas för rening och detektion av transfekterade palmitoylerade proteiner i heterologa cellkulturer, primära neuronala kulturer härledda från olika hjärnvävnader av både mus och råtta, och även primär hjärnvävnad själv.