Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel

Indre organer som hjerte, hjerne og tarm udvikle venstre-højre (LR) asymmetrier, der er kritiske for deres normale funktioner ^1. Motile cilier er involveret i at etablere LR asymmetri i hvirveldyr embryoner, herunder mus, frø, og zebrafisk ^2-6. Disse "LR cilia 'generere asymmetriske fluidstrøm, der er nødvendig for at udløse en konserveret asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamilien) signaleringskaskade i den venstre laterale plade mesoderm, som menes at tilvejebringe LR mønster information for at udvikle organer ^7. Således at forstå mekanismerne bag LR mønsterdannelse er det vigtigt at identificere gener, der regulerer tilrettelæggelsen af ​​LR cilierede celler, motilitet og længde LR cilier og deres evne til at skabe en robust asymmetrisk strømning.

I zebrafisk embryo, er LR cilia beliggende i Kupffer s vesikel (KV) ^2,4,5. KV består af et enkelt lag af monociliated epithelcellerat vedlægge en væskefyldt hulrum. Fate kortlægning har vist, at KV er afledt af en gruppe ~ 20-30 celler kendt som dorsale forløberen celler (DFCs), der vandrer på den dorsale blastoderm margin under epiboly faser ^8,9. Under tidlige somit faser, til DFCs klynge og differentiere til cilierede epitelceller danne KV i tailbud af embryonet ^10,11. Evnen til at identificere og spore DFCs-i kombination med optisk transparens og hurtig udvikling af zebrafisk embryo-gør zebrafisk KV en fremragende model til undersøgelse LR cilierede celler.

Interessant, progenitorer af DFC / KV celleafstamning bevarer cytoplasmiske broer mellem blommen celle op til 4 timer efter befrugtning (HPF), hvorimod cytoplasmiske broer mellem blommesækken celle og andre embryonale celler tæt efter 2 HPF ^8. Drage fordel af disse cytoplasmiske broer, vi udviklet en trinspecifik injektion strategi om at levere morpholino oligonucleotides (MO) udelukkende til DFCs og knockdown funktionen af en målrettet gen i disse celler ^12. Denne teknik skaber kimære embryoner i hvilket gen funktion er slået ned i DFC / KV afstamning udvikler sig i forbindelse med en vildtype-embryo. At analysere asymmetrisk fluidstrøm i KV, vi indsprøjte fluorescerende mikroperler i KV lumen og optage perle bevægelsen ved hjælp videomicroscopy ^2. Fluidstrømning er let visualiseres og kan kvantificeres ved at spore vulst forskydning over tid.

Her bruger trinspecifik DFC målrettet gen knockdown teknik og injektion af fluorescerende mikroperler i KV at visualisere flow, præsenterer vi en protokol, der giver en effektiv tilgang til at karakterisere rollen af ​​et bestemt gen i løbet af KV udvikling og funktion.