Abstract
Biology
Indre organer som hjerte, hjerne og tarm udvikle venstre-højre (LR) asymmetrier, der er kritiske for deres normale funktioner 1. Motile cilier er involveret i at etablere LR asymmetri i hvirveldyr embryoner, herunder mus, frø, og zebrafisk 2-6. Disse "LR cilia 'generere asymmetriske fluidstrøm, der er nødvendig for at udløse en konserveret asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamilien) signaleringskaskade i den venstre laterale plade mesoderm, som menes at tilvejebringe LR mønster information for at udvikle organer 7. Således at forstå mekanismerne bag LR mønsterdannelse er det vigtigt at identificere gener, der regulerer tilrettelæggelsen af LR cilierede celler, motilitet og længde LR cilier og deres evne til at skabe en robust asymmetrisk strømning.
I zebrafisk embryo, er LR cilia beliggende i Kupffer s vesikel (KV) 2,4,5. KV består af et enkelt lag af monociliated epithelcellerat vedlægge en væskefyldt hulrum. Fate kortlægning har vist, at KV er afledt af en gruppe ~ 20-30 celler kendt som dorsale forløberen celler (DFCs), der vandrer på den dorsale blastoderm margin under epiboly faser 8,9. Under tidlige somit faser, til DFCs klynge og differentiere til cilierede epitelceller danne KV i tailbud af embryonet 10,11. Evnen til at identificere og spore DFCs-i kombination med optisk transparens og hurtig udvikling af zebrafisk embryo-gør zebrafisk KV en fremragende model til undersøgelse LR cilierede celler.
Interessant, progenitorer af DFC / KV celleafstamning bevarer cytoplasmiske broer mellem blommen celle op til 4 timer efter befrugtning (HPF), hvorimod cytoplasmiske broer mellem blommesækken celle og andre embryonale celler tæt efter 2 HPF 8. Drage fordel af disse cytoplasmiske broer, vi udviklet en trinspecifik injektion strategi om at levere morpholino oligonucleotides (MO) udelukkende til DFCs og knockdown funktionen af en målrettet gen i disse celler 12. Denne teknik skaber kimære embryoner i hvilket gen funktion er slået ned i DFC / KV afstamning udvikler sig i forbindelse med en vildtype-embryo. At analysere asymmetrisk fluidstrøm i KV, vi indsprøjte fluorescerende mikroperler i KV lumen og optage perle bevægelsen ved hjælp videomicroscopy 2. Fluidstrømning er let visualiseres og kan kvantificeres ved at spore vulst forskydning over tid.
Her bruger trinspecifik DFC målrettet gen knockdown teknik og injektion af fluorescerende mikroperler i KV at visualisere flow, præsenterer vi en protokol, der giver en effektiv tilgang til at karakterisere rollen af et bestemt gen i løbet af KV udvikling og funktion.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved