Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin ¹ beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) ^1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) ^1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine ​​durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger ^4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten ^6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar - insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen - und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie ^11,12.

Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.