Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostatakreft er den ledende formen for kreftsykdom blant menn i USA Mens operasjoner innebærer en betydelig risiko for impotens og inkontinens, har tradisjonelle kjemoterapeutiske tilnærminger i stor grad vært mislykket. Hormonbehandling er effektiv på et tidlig stadium, men ofte mislykkes med eventuell utvikling av hormon-ildfaste svulster. Vi har vært interessert i å utvikle behandlingsformer rettet mot spesifikke metabolske mangel av kreftceller. Vi har nylig vist at prostata tumorceller spesifikt mangler et enzym (argininosuccinate syntase, eller ASS) som er involvert i syntesen av aminosyren arginin ^1.. Denne tilstanden fører til at kreftceller til å bli avhengig av eksogene arginin, og de ​​gjennomgår metabolsk stress når fri arginin er oppbrukt av arginin deiminase (ADI) ^1,10. Vi har faktisk vist at menneskelige prostata kreft celler CWR22 RV1 er effektivt drept av ADI med kaspase-uavhengig apoptose og aggressiv autophagy (eller macroautophagy) ^1,2,3. Autophagy er et evolusjonært bevart prosess som gjør at cellene til å forbrenne uønskede proteiner ved lysosomale sammenbrudd under ernæringsmessige sult ^4,5. Selv om de grunnleggende komponentene i denne veien er godt karakterisert ^6,7,8,9, mange aspekter av den molekylære mekanismen er fortsatt uklart - spesielt hva er rollen til autophagy i døden respons av prostata kreft celler etter ADI behandling ? For å løse dette spørsmålet, må vi en eksperimentell metode for å måle nivået og omfanget av autophagic respons i celler - og siden det er ingen kjente molekylære markører som kan nøyaktig spore denne prosessen, valgte vi å utvikle en avbildning tilnærming, ved hjelp kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi ^11,12.

Ved hjelp CWR22Rv1 celler spesifikt-merket med fluorescerende prober for autophagosomes og lysosomer, viser vi at 3D bildestakker kjøpt med enten widefield deconvolution mikroskopi (og senere, med super-oppløsning, strukturert-belysning mikroskopi) kan tydelig fange de tidlige stadiene av autophagy induksjon. Med kommersielt tilgjengelige digitale bildeanalyse applikasjoner, kan vi lett få statistisk informasjon om autophagosome og lysosome antall, størrelse, distribusjon, og graden av colocalization fra noen avbildes celle. Denne informasjonen gir oss mulighet til nettopp spore fremdriften av autophagy i levende celler og gjør vår fortsatte etterforskning i rollen som autophagy i kreft kjemoterapi.