Abstract
Biology
Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine essenziali alla midcell 1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione 3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all'interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza 5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus 7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l'applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati (PALM), per caratterizzare quantitativamente l'organizzazione strutturale della E. coli Z-ring 8.
PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un'etichettatura specifica per consentire l'identificazione univoca delle proteine bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm 9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con <20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole. <p class = "jove_content"> Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring 10 e può essere applicata ad altre proteine di interesse.
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