Protein Transfection av Mouse Lung

Økende protein uttrykk gjør forskere til bedre å forstå den funksjonelle rollen som protein i å regulere viktige biologiske prosesser ^en. I lungene, dette har blitt oppnådd typisk gjennom genetiske tilnærminger som utnytter transgene mus ^2,3 eller virale eller ikke-virale vektorer som heve protein nivåer via økt genuttrykk ^fire. Transgene mus som er kostbare og tidkrevende å generere og den tilfeldig innsetting av et transgen eller kronisk genekspresjon kan endre normal lunge utvikling og dermed begrense nytten av modell ^5. Mens betingede transgenics avverge problemer forbundet med kronisk genekspresjon ^6, omvendt tetracyclin-kontrollerte transactivator (rtTA) mus, som brukes til å generere betinget uttrykk, utvikle spontan luftrom utvidelse ^7. Som med transgenics, er bruken av virale og ikke-virale vektorer dyre ⁸ og kan provosere dose-dependent inflammatoriske responser som forvirre resultater ⁹ og hindre uttrykk ^10. Videre er effekten av gjentatte doser begrenset av forbedrede immunresponser til vektor ^11,12. Forskere utvikler adeno-assosiert virus (AAV) vektorer som provoserer mindre betennelse og har lengre uttrykk i lungene ^13.

Ved hjelp β-galaktosidase presenterer vi en fremgangsmåte for hurtig og effektivt å øke protein ekspresjon i lungene ved hjelp av en direkte protein transfeksjon teknikk. Denne protokollen blander et fast beløp på renset protein med 20 pl av en lipidbasert transfeksjon reagens (Prosjektperiodiseringer, Pierce Bio) for å tillate inntrengning i lungevevet i seg selv. Den liposomale proteinblandingen blir deretter sprøytet inn i lungene til musene via trakea ved hjelp av en microsprayer (Penn-tallet, Philadelphia, PA). Den microsprayer genererer en fin sky av flytende aerosol gjennom lungene. Ved hjelp av teknikkenVi har vist ensartet avsetning av injisert protein gjennom luftveiene og alveolene av mus ^14.. Den lipid transfeksjon teknikk tillater bruk av en liten mengde protein for å oppnå effekt. Dette begrenser betennelsesreaksjon som ellers ville bli provosert av høy protein administrasjon. Faktisk bruker denne teknikken publiserte vi at vi var i stand til å betydelig øke PP2A aktivitet i lungene uten å påvirke lunge lavage cellularitet ^15. Lunge lavage cellularitet tatt 24 timer etter smitte var sammenlignbar med kontroller (27 ± 4 kontroll vs 31 ± 5 albumin transfekterte, N = 6 per gruppe). Dessuten øker det protein nivåer uten å indusere lunge utviklingsmessige endringer eller arkitektoniske endringer som kan oppstå i transgene modeller. Imidlertid kan behovet for gjentatte administrasjoner gjøre denne teknikken mindre gunstig for studier som undersøker effekten av langsiktige økninger i protein uttrykk. Dette vil være spesielt true for proteiner med korte halveringstider.