Abstract
Biology
Økende protein uttrykk gjør forskere til bedre å forstå den funksjonelle rollen som protein i å regulere viktige biologiske prosesser en. I lungene, dette har blitt oppnådd typisk gjennom genetiske tilnærminger som utnytter transgene mus 2,3 eller virale eller ikke-virale vektorer som heve protein nivåer via økt genuttrykk fire. Transgene mus som er kostbare og tidkrevende å generere og den tilfeldig innsetting av et transgen eller kronisk genekspresjon kan endre normal lunge utvikling og dermed begrense nytten av modell 5. Mens betingede transgenics avverge problemer forbundet med kronisk genekspresjon 6, omvendt tetracyclin-kontrollerte transactivator (rtTA) mus, som brukes til å generere betinget uttrykk, utvikle spontan luftrom utvidelse 7. Som med transgenics, er bruken av virale og ikke-virale vektorer dyre 8 og kan provosere dose-dependent inflammatoriske responser som forvirre resultater 9 og hindre uttrykk 10. Videre er effekten av gjentatte doser begrenset av forbedrede immunresponser til vektor 11,12. Forskere utvikler adeno-assosiert virus (AAV) vektorer som provoserer mindre betennelse og har lengre uttrykk i lungene 13.
Ved hjelp β-galaktosidase presenterer vi en fremgangsmåte for hurtig og effektivt å øke protein ekspresjon i lungene ved hjelp av en direkte protein transfeksjon teknikk. Denne protokollen blander et fast beløp på renset protein med 20 pl av en lipidbasert transfeksjon reagens (Prosjektperiodiseringer, Pierce Bio) for å tillate inntrengning i lungevevet i seg selv. Den liposomale proteinblandingen blir deretter sprøytet inn i lungene til musene via trakea ved hjelp av en microsprayer (Penn-tallet, Philadelphia, PA). Den microsprayer genererer en fin sky av flytende aerosol gjennom lungene. Ved hjelp av teknikkenVi har vist ensartet avsetning av injisert protein gjennom luftveiene og alveolene av mus 14.. Den lipid transfeksjon teknikk tillater bruk av en liten mengde protein for å oppnå effekt. Dette begrenser betennelsesreaksjon som ellers ville bli provosert av høy protein administrasjon. Faktisk bruker denne teknikken publiserte vi at vi var i stand til å betydelig øke PP2A aktivitet i lungene uten å påvirke lunge lavage cellularitet 15. Lunge lavage cellularitet tatt 24 timer etter smitte var sammenlignbar med kontroller (27 ± 4 kontroll vs 31 ± 5 albumin transfekterte, N = 6 per gruppe). Dessuten øker det protein nivåer uten å indusere lunge utviklingsmessige endringer eller arkitektoniske endringer som kan oppstå i transgene modeller. Imidlertid kan behovet for gjentatte administrasjoner gjøre denne teknikken mindre gunstig for studier som undersøker effekten av langsiktige økninger i protein uttrykk. Dette vil være spesielt true for proteiner med korte halveringstider.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved