Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine ​​fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter ^1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti ^8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l'utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l'integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell'utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine ​​con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine ​​di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l'uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine ​​nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine ​​che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.