Gene Fangst Bruke Gal4 i sebrafisk

Stor kullstørrelse og ekstern utvikling av optisk gjennomsiktig embryo gjør sebrafisk en eksepsjonell virveldyr modellsystem for in vivo innsettingen mutagenese ved hjelp av fluorescerende journalister å tagge uttrykk av muterte gener. Flere laboratorier har konstruert og testet enhancer-og gen-felle vektorer i sebrafisk, ved hjelp av fluorescerende proteiner, Gal4-og Lexa-baserte transkripsjonsaktivatorer som journalister ^1-7. Disse vektorene hadde to mulige ulemper: suboptimal stringens (f.eks manglende evne til å skille mellom enhancer-og gen-felle hendelser) og lav mutagenisitet (f.eks integrasjoner i genene sjelden produsert null alleler). Gene Breaking transposon (GBTs) ble utviklet for å møte disse ulempene ^8-10. Vi har modifisert av en av de første GBT vektorer, GBT-R15, for bruk med Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter og lagt UAS: eGFP som sekundær reporter for direkte påvisning av genet felle arrangementer. Application av Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter gir to fordeler. Først, det øker følsomheten for gener uttrykt på lave nivåer. For det andre gjør det forskere å bruke genet felle linjer som Gal4 drivere til direkte uttrykk for andre transgener i svært spesifikke vev. Dette er spesielt relevant for gener med ikke-essensielle eller overflødige funksjoner der genet felle integrering ikke kan resultere i overt fenotyper. Ulempen ved å bruke Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter er at gener som koder for proteiner med N-terminal signalsekvenser er ikke mottagelig for fangst, som de resulterende Gal4-VP16 fusjonsproteiner er trolig ikke være i stand til å gå inn i cellekjernen og aktivere transkripsjon. Viktigere er bruken av Gal4-VP16 ikke pre-selektere for kjerneproteiner: vi gjenvunnet genet felle mutasjoner i gener som koder for proteiner som virker på kjernen, cytoplasma og plasmamembranen.