Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine ​​di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l'associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l'idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L'innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l'espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.