El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios

Las superficies apical y basolateral de las células epiteliales de las vías respiratorias demostrar respuestas direccionales de la exposición patógeno in vivo. Por lo tanto, ideal en modelos in vitro para el examen de las respuestas celulares a patógenos respiratorios polarizan, formando superficies apical y basolateral. Uno de estos modelos se diferencian normales células epiteliales bronquiales humanas (NHBE). Sin embargo, este sistema requiere muestras de tejido pulmonar, la experiencia aislar y cultivar células epiteliales de tejido, y el tiempo para generar una cultura interfase aire-líquido.

Calu-3 células, derivadas de un adenocarcinoma bronquial humano, son un modelo alternativo para el examen de la respuesta de las células epiteliales de vías respiratorias proximales al insulto respiratoria ^1, los compuestos farmacológicos ^{2-6, 7-9} y bacterianas y patógenos virales, incluyendo el virus de la influenza, rinovirus y el síndrome respiratorio agudo severo - coronavirus asociado al ^10-14. Recientemente, we demostrado que Calu-3 células son susceptibles a virus sincitial respiratorio (RSV) en una manera consistente con NHBE ^15,16. Aquí, detalles de la creación de un polarizada, líquido cubierto de cultivo (LCC) de Calu-3 células, centrándose en los detalles técnicos de crecimiento y cultivo de células Calu-3, el mantenimiento de las células que han sido cultivadas en LCC, y se presenta el método para realizar la infección de virus respiratorio polarizadas Calu-3 células.

Para obtener de forma polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células deben ser cuidadosamente subcultivaron antes de cultivar en inserciones Transwell. Calu-3 cultivos en monocapa debe permanecer por debajo de 90% de confluencia, se debe subcultivar menos de 10 veces de stock congelado, y regularmente debe ser suministrado con medio fresco. Una vez cultivadas en transwells, Calu-3 LCC debe ser manejado con cuidado. Los cambios de medios irregulares y la interrupción mecánica o física de las capas de células o placas de polarización para impactar negativamentevarias horas o días. La polarización se controla mediante la evaluación de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y se verificó mediante la evaluación de la equilibración pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral ^17,18. Una vez mesetas TEER igual o superior a 1000 Ω x cm ^2, Calu-3 LCC está listo para usar para examinar la respuesta celular a los patógenos respiratorios.