Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener

Den apikala och basolaterala ytor epitelceller i luftvägarna visar riktade svar på patogen exponering in vivo. Således perfekt in vitro-modeller för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener polarisera och bildar apikala och basolaterala ytor. En sådan modell är differentierad normala humana bronkialepitelceller (NHBE). Emellertid kräver detta system lung vävnadsprover, expertis isolering och odling epitelceller från vävnad, och tid för att generera ett luft-vätske-gränssnittet kultur.

Calu-3-celler, härledda från en human bronkial adenokarcinom, är en alternativ modell för att undersöka gensvaret hos proximala epitelceller i luftvägarna till respiratorisk förolämpning ^1, farmakologiska föreningar ^2-6, och bakteriella ^7-9 och virala patogener, inklusive influensavirus, rhinovirus och svår akut respiratorisk sjukdom - associerad coronavirus ^10-14. Nyligen, we visade att Calu-3-celler är känsliga för respiratoriskt syncytialvirus (RSV) infektion på ett sätt som överensstämmer med NHBE ^15,16. Här har vi detalj inrättandet av en polariserad, flytande täckta kultur (LCC) i Calu-3-celler, med fokus på de tekniska detaljerna i växande och odling Calu-3-celler, underhåll celler som har odlats i LCC, och vi presenterar metod för att utföra respiratorisk virusinfektion av polariserade Calu-3-celler.

Att konsekvent erhålla polariserad Calu-3 LCC, Calu-3 celler måste noggrant subodlas före odling i Transwell skär. Calu-3 monoskiktkulturer bör förbli under 90% sammanflöde, bör subkultiveras färre än 10 gånger från frysta lager, och bör regelbundet förses med färskt medium. När odlas i Transwells måste Calu-3 LCC hanteras varsamt. Oregelbundna media förändringar och mekanisk eller fysisk störning av cellskikten eller plattor inverka negativt polarisering förflera timmar eller dagar. Polarisering övervakas genom att utvärdera trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) och verifieras genom att utvärdera den passiva utjämning av natriumfluorescein mellan de apikala och basolaterala fack ^17,18. När TEER platåer vid eller över 1.000 Ω × cm ^2, Calu-3 LCC är redo att använda för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener.