Unterstützt von den National Institutes of Health Gewährung R01EY018144.

Ein. Produktion, Rückfaltung und HPLC Aufreinigung von Holo-RBP <ol><li> Transformieren BL-21cells mit dem pET3a Vektor beherbergen die cDNA für humanes RBP mit 6x His-Tag am N-Terminus. Wachsen die transformierten BL-21-Zellen in einem Schüttler bei 37 ° C in 40 ml LB-Medium mit Carbenicillin bis OD bei 600 nm erreicht, 0.5. Induzieren RBP Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C weitere 5 Stunden. </li><li> RBP in E.coli produziert wird meist in unlöslichen Ei...

Wir teilen hier eine optimierte RBP Produktion Protokoll, weil RBP Produktion und Reinigung Verfahren kritisch zu generieren korrekt gefaltet RBP sind. Angesichts der Möglichkeit von falsch gefalteten Spezies RBP und das Vorhandensein von Spurenmengen von bakteriellen Proteinen, auch bei HPLC gereinigten RBP bakteriell gebildete, ist es hilfreich zu nativem RBP aus Serum zu verwenden, um eine Aussage bezüglich RBP bestätigen. Urin RBP, welches kommerziell erhältlich ist, ist ein komplexes Gemisch von vielen Arten vo...

Vitamin A ist ein organisches Molekül, das essentiell für das Überleben der Menschheit und das reibungslose Funktionieren fast aller menschlichen Organen. Vitamin A-Derivate (Retinoide) in verschiedenen biochemischen und zellulären Ereignisse, einschließlich der Erfassung von Licht zum Sehen 1,2 und der Regulation der Genexpression und Proteintranslation während der Embryonalentwicklung und in adulten Geweben 3-6 teilzunehmen. Obwohl Retinol hat die Fähigkeit, systemisch diffundieren, kam Evolution mit Plasma Retinol bindendes Protein, ein spezifischer Trägerprotein für Vitamin A im Blut eine hohe Effizienz und Spezifität zu erreichen und Toxizität mit zufälligen Diffusion 7-10 einhergehen, zu vermeiden. Ein Rezeptor mit hoher Affinität, die RBP bindet und nimmt Vitamin A wurde in den 1970er Jahren 11-13 vermutet. Trotz Beweise in drei Jahrzehnten von der Existenz des RBP-Rezeptor 14-31 angesammelt, wurde der Rezeptor-Hypothese seit vielen Jahren aufgrund der existenc diskutierte einer falschen Definition von Holo-RBP. Die korrekte Definition von Holo-RBP ist, dass es die hohe Affinität 1:1-Komplex aus Retinol und RBP ist. Wiederholte Extraktion von Holo-RBP durch organische Lösungsmittel ist notwendig, um apo-RBP produzieren. Diese Definition wird von fast allen Labors studieren RBP 7,9,32-35 oder die RBP-Rezeptor 14-31,36-42 verwendet. Die falsche Definition von Holo-RBP, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zu widerlegen wurde, ist die akute Mischung aus freien Retinol mit apo-RBP. Da die Funktion des Rezeptors in RBP Vitamin A Aufnahme von Holo-RBP ist Retinol von Holo-RBP freisetzen würde die RBP-Rezeptor keine Rolle spielen, wenn Retinol Aufnahme Retinol frei zu beginnen (wie durch die falsche Definition von Holo vorgeschlagen -RBP). Die jüngste Identifizierung von RBP Rezeptors als multitransmembrane Domain Protein namens STRA636 und seine Funktion in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP 36-43 dringend spricht gegen die Hypothese, dass RBP nichtbenötigen einen Rezeptor an Vitamin A. Detaillierte Analysen zeigten, dass Stra6 9 Transmembrandomänen mit dem N-Terminus extrazellulär lokalisiert und C-Terminus lokalisiert intrazellulär 40 weist liefern. Das zwischen Transmembran 6 und 7 ist ein wesentlicher RBP Bindungsdomäne 39. Stra6 ist sowohl LRAT und CRBP-I in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP verbunden, aber weder LRAT noch CRBP-I ist absolut für eine verbesserte Stra6 Aktivität 41 erforderlich. Stra6 Fähigkeit zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren ist der Schlüssel zu ihrer Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität 41. Durch das Abstützen auf Stra6 seiner Retinol freisetzen kann Vitamin A Lieferung durch RBP transportieren Vitamin A, um Zellen in den peripheren Geweben mit hoher Spezifität und Effizienz zielen. Die kritische Bedeutung des Holo-RBP Definition und Vorbereitung wird nicht nur durch die historische Debatte über die Existenz der RBP-Rezeptor dargestellt, sondern auch durch drei verwandten letzten Papiere auf Holo-RBP Definitionen dif Basisschiedenen von der ursprünglichen und korrekte Definition 44-46. Das erste Papier verwendet den Holo-RBP-Definition, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zur Untersuchung der RBP-Rezeptor 44 missbilligen wurde. Die zweite und dritte Papieren kam mit einer dritten Definition von Holo-RBP daß sie noch weniger wahrscheinlich Retinol untersucht werden, um eine ordnungsgemäße Anlage mit RBP 45,46 bilden. Diese Studien vorbereitet 3 H-retinol/RBP durch Mischen Holo-RBP (auch nicht apo-RBP) mit 3 H-Retinol. Da dieser Test nicht über 3 H-retinol/RBP gebildet und entfernte nicht übermäßigen freien 3 H-Retinol 45,46, es ist nicht ein Assay für 3 H-Aufnahme aus Retinol 3 H-retinol/RBP, sondern eine freie 3 H-Retinol Diffusionsassay. Es wurde zuvor daß Stra6 verbessert nicht zelluläre Aufnahme von Retinol frei von LRAT 38 oder CRBP-I 41 gezeigt. Praktisch alle Retinol zwangsläufig im Blut RBP und es keinen nachweisbaren free Retinol. Eine Hauptfunktion des RBP Rezeptor zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren während Retinol-Aufnahme von Holo-RBP 41. Wenn das Retinol künstlich freigesetzt wird oder in der freien Form mit 45,46 beginnen, wird die RBP-Rezeptor nicht erforderlich. Die drastisch unterschiedliche Ergebnisse aus der freien Retinol Diffusionsassay erhalten, um Tests auf richtig vorbereiteten Holo-RBP zeigen, dass die richtige Zubereitung von RBP Basis gegenüber ist entscheidend für seine funktionellen Assays. RBP kann aus menschlichem Serum 41 gereinigt werden, aber das Verfahren ist aufwendig, und die Ausbeute ist gering. Ein alternativer Ansatz ist die RBP in E. produzieren coli. Weil E. coli nicht in der Lage, richtig zu falten Säuger sezernierten Proteinen mit mehr als einem Paar von Disulfidbindungen wie RBP, ist es wesentlich, refold Rbp und reinigen das korrekt gefaltete Protein. Falsch gefaltete Proteine ​​nicht nur anders korrigiert gefalteten RBP in verschiedenen Tests verhalten,aber auch dazu führen, Proteinaggregation während der Lagerung. Aus dem gleichen Grund wird apo-RBP nur aus hochwertigem Holo-RBP hergestellt. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll zur Herstellung von hochwertigen RBP 100% mit Retinol durch bakterielle Expression, Rückfaltung und HPLC-Reinigung geladen. HPLC-Reinigung entfernt nicht nur falsch gefaltete RBP aber auch erhebliche bakterielle Kontamination, die schwere Artefakte verursachen kann, wenn RBP in der Signaltransduktion Assays verwendet wird. Wir beschreiben auch zwei empfindliche Echtzeit-Monitoring-Techniken zu Retinol Transport per Stra6 studieren. Beide Techniken sind abhängig von hoher Qualität RBP. Aus Platzgründen werden die klassischen Techniken der radioaktiven Retinoid-basierten und HPLC-basierte Vitamin-A-Aufnahme-Assays werden hier nicht beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fischer </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> Retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Fischer </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Casein </td><td> Durchstechen </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Platte </td><td> Fischer </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze Gasdichte # 1710 </td><td> Fischer </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Vitamin A ist für das Sehen wichtig und das Wachstum / Differenzierung von fast allen menschlichen Organen. Plasma Retinol bindendes Protein (RBP) ist das Prinzip und spezielle Träger von Vitamin A im Blut. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Holo-RBP und zwei Echtzeitüberwachung Techniken, um den Transport von Vitamin A durch den hochaffinen Rezeptor RBP Stra6 studieren. Die erste Technik ist es möglich, eine große Menge an qualitativ hochwertigen Holo-RBP (100% mit Retinol-loaded) für Vitamin A Transport-Assays zu erzeugen. Hochwertige RBP ist essentiell für funktionelle Assays, weil fehlgefaltete RBP Versionen Vitamin A leicht und bakterielle Kontamination in RBP Vorbereitung kann Artefakte verursachen. Echtzeit-Überwachung Techniken wie Elektrophysiologie wurden kritische Beiträge zu den Untersuchungen von Membran-Transport gemacht. Die RBP rezeptorvermittelte Retinol Transport nicht in Echtzeit bis vor kurzem wurden analysiert. Der zweite hier beschriebene Technik ist der Grundl-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Freisetzung oder loading. Die dritte Technik ist die Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP, um zelluläre Retinol bindendes Protein I (CRBP-I). Diese Techniken bieten eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung bei der Aufdeckung RBP Rezeptors Vitamin A-Aufnahme-Mechanismus.

Wir stellen Ihnen hier repräsentative Ergebnisse für Holo-RBP Produktion und Reinigung durch HPLC (Abbildung 1), Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Release von Holo-RBP und Retinol Laden in apo-RBP (Abbildung 2) und Echtzeit-Analyse Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I (Abbildung 3). Ohne Rückfaltung, hergestellt RBP in Bakterien fast vollständig fehlgefaltete aufgrund der Anwesenheit von vielen...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...