Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murino de trasplante de médula ósea modelos constituyen una herramienta importante en la medición de células madre hematopoyéticas (HSC) y los genes que determinan las funciones / moléculas que regulan las CMH. En estos sistemas modelo de trasplante, la función de HSCs se determina por la capacidad de estas células a ratones injertan y reconstituir receptores irradiados letalmente. Comúnmente, la célula donante contribución / injerto se mide por los anticuerpos específicos de donante-proteínas de superficie celular por citometría de flujo. Sin embargo, este método depende en gran medida de la especificidad y la capacidad del marcador de superficie celular para diferenciar las células derivadas del donante de células receptoras originados, que pueden no estar disponibles para todas las cepas de ratón. Teniendo en cuenta los diversos antecedentes de cepas de ratón genéticamente modificados en el mercado, esta superficie de la célula / citometría de flujo basado en el método tiene limitaciones importantes, especialmente en las cepas de ratón que carecen bien definidos marcadores de superficie de células donantes separados de congenic destinatario cells. Aquí, se informó de una técnica basada en PCR para determinar quimerismo de células donantes / contribución en los ratones receptores de trasplante. Hemos trasplantado machos donantes de médula ósea a HSCs irradiados letalmente ratones hembra congénicos. Muestras de sangre periférica fueron recolectadas en diferentes tiempos después del trasplante puntos. Muestras de médula ósea se obtuvieron al final de los experimentos. ADN genómico se aisló y el gen específico de cromosoma Y, Zfy1, se amplificó utilizando PCR en tiempo real cuantitativa. El injerto de los machos células derivadas del donante en los ratones receptores hembra se calculó contra curva estándar con un porcentaje conocido de los ADN macho contra hembra. Bcl2 se utilizó como gen de referencia para normalizar la cantidad de ADN total. Nuestros datos sugiere que este enfoque fiable determina quimerismo de células donantes y proporciona un método útil, pero sencillo en la medición de la reconstitución de células hematopoyéticas en modelos murinos trasplante de médula ósea. Nuestro método puede ser realizada de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios porque noequipos costosos tales como la citometría de flujo se requiere.