Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver

Laser mikrodissektion (LMD) er en teknik, der tillader inddrivelse af udvalgte celler og væv fra små mængder af parenkym ^1,2. De dissekerede celler kan anvendes til forskellige undersøgelser, såsom transkriptom eller proteom undersøgelser, DNA vurdering eller kromosomanalyse ^2,3. En særligt udfordrende anvendelse af LMD er transkriptomet analyse, som på grund af labiliteten af RNA ^4, kan være særlig fremtrædende, når cellerne dissekeres fra væv, der er rige af RNaser, såsom pancreas. En mikrodissektion protokol, der muliggør hurtig identifikation og indsamling af målceller er afgørende i denne indstilling for at afkorte vævet håndtering tid og dermed for at sikre RNA konservering.

Her beskriver vi en protokol for at erhverve betaceller fra menneskets bugspytkirtel fra kirurgiske enheder, der skal bruges til transkriptomisk undersøgelser ^5. Små stykker af pancreas fra ca 0,5 til 1 cm ³ blev udskåret fra de sunde anført tilknytning operativt fjernede pancreas prøver, indlejret i Tissue-Tek OCT-forbindelse, øjeblikkeligt nedfrosset i kølede 2-methylbutan og opbevaret ved -80 ° C indtil skæring. Fyrre serielle sektioner af 10 um tykkelse blev skåret på en kryostat i henhold til en -20 ° C indstilling, overført individuelt til glasplader, tørret inde i kryostaten i 1-2 min, og opbevaret ved -80 ° C.

Umiddelbart før laser mikrodissektion procedure blev snit fikseret i iskold, frisk fremstillet 70% ethanol i 30 sekunder, vaskes med 5-6 dyk i iskold DEPC-behandlet vand og dehydratiseret med to en-minutters inkubationer i iskoldt 100% ethanol efterfulgt af xylen (som anvendes til væv dehydrering) i 4 min; Vævssnit blev derefter lufttørret bagefter i 3-5 min. Vigtigere, alle trin med undtagelse af inkubering i xylen, udføres brugte iskolde reagenser - en modifikation i løbet af en tidligere beskrevet protokol ^6. Utilization iskold reagenser resulterede i en markant stigning af den indre autofluorescens af betaceller, og lettet deres anerkendelse. Til mikrodissektion, var fire sektioner dehydrerede hver gang: to blev anbragt i en folieomviklede 50 ml glas for at beskytte vævet mod fugt og blegning, de resterende to straks blev microdissected. Denne procedure blev udført ved anvendelse af en PALM MicroBeam instrument (Zeiss) under anvendelse af Auto Laser Pressure catapulting (AutoLPC) tilstand. Færdiggørelsen af ​​beta celle / ø dissektion fra fire kryosektioner kræves ikke længere end 40-60 min. Celler blev opsamlet i en AdhesiveCap og lyseret med 10 pi lysisbuffer. Hver enkelt RNA-prøve for transkriptom analyse blev opnået ved at kombinere 10 celle microdissected prøver, efterfulgt af RNA-ekstraktion ved hjælp af Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Denne protokol forbedrer den iboende autofluorescens af humane betaceller, hvilket letter deres hurtige og præcise anerkendelse og collection. Yderligere forbedring af denne procedure kunne gøre det muligt dissektion af fænotypisk forskellige betaceller, med mulige konsekvenser for bedre at forstå de ændringer, der er forbundet med type 2 diabetes.