Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

Laser microdissectie (LMD) is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen en weefsels van kleine hoeveelheden parenchym ^1,2 toelaat. De gedissecteerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende onderzoeken, zoals transcriptoom of proteomische studies, DNA assessment of chromosoomanalyse ^2,3. Een bijzondere uitdaging toepassing van LMD transcriptoomanalyse, die vanwege de labiliteit van RNA ^4, kan bijzonder prominent wanneer cellen worden geprepareerd uit weefsels die rijk RNases zoals de pancreas. Een microdissection protocol dat snelle identificatie en verzameling van doelwitcellen kan essentieel in deze instelling om het weefsel verwerkingstijd verkorten en dus om RNA houdbaarheid.

Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische beta cellen van chirurgische specimens worden gebruikt voor studies transcriptoom ^5. Kleine stukjes van de alvleesklier van ongeveer 0,5-1 cm ³ werden uit de gezonde weergegeven marges van operatief pancreas specimens, ingebed in Tissue-Tek oktober verbinding, direct ingevroren in 2-methylbutaan gekoeld en opgeslagen bij -80 ° C tot snijden. Veertig seriële secties van 10 um dikte werden gesneden op een cryostaat onder -20 ° C instelling afzonderlijk overgebracht naar glazen objectglaasjes, gedroogd in de cryostaat voor 1-2 min en bewaard bij -80 ° C.

Onmiddellijk vóór de laser microdissectie procedure werden secties gefixeerd in ijskoude, versbereide 70% ethanol gedurende 30 seconden, gewassen met 5-6 dips in ijskoud DEPC-behandeld water, en gedroogd door twee minuut incubaties in ijskoude 100% ethanol gevolgd door xyleen (die wordt gebruikt voor weefseldehydratatie) gedurende 4 min; weefselcoupes werden vervolgens aan de lucht gedroogd daarna gedurende 3-5 min. Belangrijker alle stappen behalve de incubatie in xyleen werden uitgevoerd met ijskoude reagentia - een wijziging op een eerder beschreven protocol ^6. Utilization van ijskoude reagentia resulteerde in een sterke stijging van de intrinsieke autofluorescentie van beta-cellen, en gefaciliteerd hun erkenning. Voor microdissectie, vier secties werden gedehydrateerd telkens: twee werden in een folie verpakte 50 ml buis, het weefsel bescherming tegen vocht en bleken, de twee andere werden onmiddellijk gemicrodissecteerde. Deze procedure werd uitgevoerd met een PALM microbundel instrument (Zeiss) onder toepassing van de Auto Laser Pressure Wegslingeren (AutoLPC) mode. De voltooiing van beta cel / eilandje dissectie van vier cryocoupes die niet meer nodig zijn dan 40-60 min.. Cellen werden verzameld in een AdhesiveCap en gelyseerd met 10 ui lysis buffer. Elke afzonderlijke RNA monster voor transcriptoom analyse werd verkregen door het combineren van 10 cellen gemicrodissecteerde monsters, gevolgd door RNA-extractie met behulp van de Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Dit protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun snelle en accurate herkenning en collectie. Verdere verbetering van deze procedure in staat kan stellen de dissectie van fenotypisch verschillende beta-cellen, met mogelijke consequenties voor een beter begrip van de veranderingen die gepaard gaan met diabetes type 2.