פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

microdissection הליזר (LMD) הוא טכניקה המאפשרת ההתאוששות של תאים ורקמות שנבחרו מכמויות זעירות של parenchyma ^1,2. התאים הגזורים יכולים לשמש למגוון רחב של חקירות, כגון מחקרי transcriptomic או proteomic, הערכה או ניתוח דנ"א הכרומוזומלי ^2,3. יישום מאתגר במיוחד של LMD הוא ניתוח transcriptome, אשר, בשל הרפיפות של רנ"א ^4, יכול להיות בולט במיוחד כאשר תאים גזורים מרקמות עשירות של RNases, כגון לבלב. פרוטוקול microdissection שמאפשר זיהוי ואיסוף מהיר של תאי היעד חיוני בהגדרה זו כדי לקצר את זמן הטיפול ברקמות וכתוצאה מכך, על מנת להבטיח שימור RNA.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת תאים בטאו בלבלב אנושי מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic ^5. חתיכות קטנות של לבלב של ג כ 0.5-1³ מ 'נחתכו מהשולים הבריאים המופיעים בדגימות לבלב resected, המשובצים ברקמות-Tek מתחם אוקטובר, הקפואים מייד ב2-Methylbutane מצונן, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שחתך. ארבעים קטעים סידוריים של עובי מיקרומטר 10 נחתכו בcryostat תחת -20 ° C הגדרה, הועברו באופן פרטני לשקופיות זכוכית, התייבשו בתוך cryostat ל1-2 דקות, ומאוחסנים ב-80 ° C.

מייד לפני הליך microdissection הליזר, סעיפים תוקנו בקר כקרח, מוכן טרי אתנול 70% למשך 30 שניות, נשטפו על ידי 5-6 מטבלים במים קרים כקרח DEPC טופלו, ומיובש על ידי שתי incubations של דקה אחת ב100% קרים כקרח אתנול ואחריו קסילן (המשמש להתייבשות רקמות) עבור 4 דקות; חלקי רקמה היו אז אוויר יבשים לאחר מכן במשך 3-5 דקות. חשוב לציין, בכל הצעדים, למעט הדגירה בקסילן, בוצעו באמצעות ריאגנטים קרים כקרח - שינוי מעל ⁶ פרוטוקול שתואר לעיל. Utilization של ריאגנטים קרח קרים ביאה לעלייה בולטת של autofluorescence הפנימית של תאים בטאו, ואפשר זיהוי שלהם. לmicrodissection, ארבעה חלקים היו מיובשים בכל פעם: שתיים להציב לתוך צינור עטוף בנייר האלומיניום 50 מ"ל, כדי להגן על הרקמות מפני רטיבות והלבנה; 2 נותרי microdissected באופן מיידי. הליך זה בוצע באמצעות מכשיר PALM Microbeam (Zeiss) העסקת לחץ הליזר האוטומטי catapulting מצב (AutoLPC). ההשלמה של תאי הבטא / נתיחת איון מהארבעה cryosections נדרש לא יותר מ40-60 דקות. תאים נאספו לAdhesiveCap אחד וlysed עם חיץ תמוגה 10 μl. כל דגימת RNA בודדה עבור ניתוח transcriptomic הושגה על ידי שילוב של 10 דגימות תאים microdissected, ואחרי מיצוי RNA באמצעות פיקו הטהור רנ"א בידוד הקיט (ארקטורוס). פרוטוקול זה משפר autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל ההכרה וג המהיר והמדויקת שלהםollection. שיפור נוסף של הליך זה יכול לאפשר נתיחה של תאי הביתא phenotypically שונים, עם השלכות אפשריות להבנה טובה יותר של שינויים הקשורים בסוכרת מהסוג 2.