Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Microdissezione laser (LMD) è una tecnica che consente il recupero di cellule e tessuti selezionati da piccole quantità di parenchima ^1,2. Le cellule sezionato possono essere utilizzati per una varietà di indagini, come gli studi di proteomica, trascrittomica o di valutazione o analisi del DNA cromosomico ^2,3. Un'applicazione particolarmente impegnativa LMD è l'analisi del trascrittoma, che, a causa della instabilità del RNA ^4, può essere particolarmente importante quando le cellule vengono sezionati da tessuti che sono ricchi di RNasi, come il pancreas. Un protocollo microdissezione che consente una rapida identificazione e raccolta delle cellule bersaglio è essenziale in questa impostazione per abbreviare il tempo di movimentazione del tessuto e, di conseguenza, per garantire la conservazione dell'RNA.

Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di cellule beta pancreatiche da campioni chirurgici di essere utilizzati per lo studio trascrittomica ^5. Piccoli pezzi di pancreas di circa 0,5-1 cm ³ sono stati tagliati dai margini sani figuranti di campioni resecati pancreas, incorporati in Tissue-Tek Compound ottobre, immediatamente congelati in refrigerata 2-metilbutano, e conservati a -80 ° C fino al sezionamento. Quaranta sezioni seriali di spessore 10 um sono state tagliate su un criostato in un ambiente -20 ° C, trasferite individualmente i vetrini, essiccate all'interno del criostato per 1-2 min, e conservati a -80 ° C.

Immediatamente prima della procedura microdissezione laser, le sezioni sono state fissate in ghiaccio freddo, preparata etanolo al 70% per 30 sec, lavato da 5-6 cali di ghiaccio freddo acqua trattata con DEPC, e disidratato per un minuto due incubazioni in ghiaccio freddo 100% etanolo seguita da xilene (che viene usato per la disidratazione del tessuto) per 4 min, sezioni di tessuto sono state poi essiccate dopo per 3-5 min. È importante sottolineare che tutti i passi, eccetto l'incubazione in xilene, sono stati eseguiti utilizzando ghiacciata reagenti - una modifica su un protocollo precedentemente descritto ^6. Utilization di reagenti ghiaccio freddo ha determinato un aumento marcato della autofluorescenza intrinseca delle cellule beta, e facilitato il loro riconoscimento. Per microdissezione, quattro sezioni erano disidratati ogni volta: due sono stati posti in una pellicola protettiva tubo da 50 ml, per proteggere i tessuti da umidità e sbiancamento, gli altri due sono stati immediatamente microdissezione. Questa procedura è stata eseguita utilizzando un PALM MicroBeam strumento (Zeiss) che impiega il laser a pressione Auto catapultando (AutoLPC) modalità. Il completamento di cellule beta / dissezione isolotto da quattro criosezioni necessari non più di 40-60 min. Le cellule sono state raccolte in un unico AdhesiveCap e lisate con 10 microlitri di tampone di lisi. Ogni singolo campione di RNA per analisi trascrittomica stata ottenuta combinando 10 campioni cellulari microdissezione, seguita da estrazione RNA utilizzando il Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Questo protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro rilevazione rapida e precisa e Collezione. Ulteriore miglioramento di questa procedura potrebbe consentire la dissezione delle cellule beta fenotipicamente diversi, con possibili implicazioni per una migliore comprensione dei cambiamenti associati al diabete di tipo 2.