手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

レーザーマイクロダイセクション（LMD）は実質^1,2分の金額から選択した細胞や組織の回復を可能にする技術です。解剖した細胞は、トランスクリプトームやプロテオーム研究は、DNAや染色体分析評価^2,3として調査、種々の用途に使用することができます。 LMDの特に困難なアプリケーションは、RNA ⁴の不安定性に起因して、細胞は、膵臓などのRNaseの豊富な組織から解剖される場合に特に顕著であることができ、トランスクリプトーム解析、です。標的細胞の迅速な識別と収集を可能に顕微解剖プロトコルは組織の処理時間を短くすると、その結果、RNAの保全性を確保するためには、この設定には不可欠です。

ここでは、トランスクリプトーム研究⁵に使用する手術標本からヒト膵β細胞を取得するためのプロトコルを記述します。約0.5〜cの膵臓の小片m ^3をティッシュテックOCTコンパウンド、直ちに2 -メチルブタンチルドで凍結し、-80℃で保存しセクショニングまで、Cに埋め込 ​​ま摘出膵臓標本の健康現れるマージン、から切り出した。 10μmの厚さの四連続切片1〜2分間クライオスタット内部に乾燥したガラススライドに個別に転送-20℃設定、、、下のクライオスタットでカットし、-80℃で保存した

直ちにレーザーマイクロダイセクションの手順の前に、切片を氷冷100％の2つの1分インキュベーションすることにより、氷の寒さの中に固定されたばかりの30秒間、70％エタノールを調製し、氷冷DEPC処理水で5月6日ディップで洗浄し、脱水したエタノールは4分間キシレン（組織の脱水に使用される）に続いて、組織切片を3〜5分間、その後、風乾した。重要なことは、すべての手順は、キシレン中でのインキュベーションを除いて、氷のように冷たいの試薬 ​​を用いて行った-以前に記述されたプロトコル⁶以上修正。 UT氷冷試薬のilizationは、ベータ細胞の内因自家蛍光の顕著な増加をもたらした、との認識を容易にした。顕微解剖のために、4つのセクションでは、各時間脱水した：2、ホイル·ラップに入れた50 mlチューブ、湿気や漂白から組織を保護するために、残りの2は直ちに顕微解剖された。この手順は、（AutoLPC）モードに突入させた自動レーザ圧接を採用PALMマイクロビーム装置（Zeiss）を用いて行った。 40-60分よりもはや不要4凍結切片からベータ細胞/小島清の完成。細胞は1 AdhesiveCapに集め、10μlの溶解緩衝液で溶解した。トランスクリプトーム解析のために、それぞれの単一のRNA試料がピコ純粋なRNA単離キット（アルクトゥルス）を用いてRNAを抽出し、10セル顕微サンプルを結合することにより得た。このプロトコルは、このように彼らの迅速かつ正確な認識とcを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を改善ollection。この手順のさらなる改善は、2型糖尿病に伴う変化を理解するためのより良い可能性のある影響で、表現型が異なるβ細胞の解剖を可能にするかもしれません。