La medición de pH vacuolar y citosólica

Vacuolar y el pH citosólico están altamente regulados en células de levadura y ocupan un papel central en la homeostasis global de pH. Se describen protocolos para la medición radiométrica de pH in vivo utilizando fluoróforos sensibles al pH localizadas en la vacuola o citosol. PH vacuolar se mide usando BCECF, que se localiza en la vacuola en la levadura cuando se introduce en las células en su forma de éster de acetoximetilo. PH citosólico se mide con una GFP sensible al pH expresado bajo el control de un promotor de levadura, levadura pHluorin. Se describen métodos para la medición de fluorescencia ratios en suspensiones de células de levadura en un fluorímetro. A través de estos protocolos, mediciones puntuales de tiempo individuales de pH bajo condiciones diferentes o en diferentes mutantes de levadura se han comparado y los cambios de pH a través del tiempo han sido controlados. Estos métodos también se han adaptado a un formato de lector de placas de fluorescencia para experimentos de alto rendimiento. Ventajas de las mediciones de pH ratiometric más de otros APTambién se describen los enfoques actualmente en uso, posibles problemas y soluciones experimentales, y las perspectivas para el futuro uso de estas técnicas.