Mätning av vakuolär och cytosolisk pH

Vakuolär och cytosolisk pH är starkt reglerad i jästceller och intar en central roll i den övergripande pH homeostas. Vi beskriver protokoll för ratiometrisk mätning av pH in vivo med hjälp av pH-känsliga fluoroforer lokaliserade till vakuolen eller cytosolen. Vakuolär pH mäts med BCECF, som lokaliserar till vakuolen i jäst när de införs i celler i sin acetoximetylester formulär. Cytosoliskt pH mäts med en pH-känslig GFP uttryckt under kontroll av en jästpromotor, jäst pHluorin. Metoder för mätning av fluorescens förhållanden i suspensioner jästcell i en fluorimeter beskrivs. Genom dessa protokoll har enstaka tidpunkt mätningar av pH under olika förhållanden eller i olika jästmutanter jämförts och förändringar i pH över tiden har övervakats. Dessa metoder har också anpassats till en fluorescens plattläsaren format för hög genomströmning experiment. Fördelar med ratiometrisk pH-mätningar över andra apinfallsvinklar för närvarande är i bruk, eventuella experimentella problem och lösningar, samt utsikterna för framtida användning av dessa tekniker beskrivs också.