एक घर का बना दोहरे चमक luciferase परख का उपयोग उच्च throughput कार्यात्मक स्क्रीनिंग

हम अल्फा synuclein, पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े जीन की transcriptional नियामकों की पहचान करने के लिए एक तेजी से और सस्ती उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल उपस्थित थे. 293T कोशिकाओं transiently एक एक जीन प्रति अच्छी तरह से microplate प्रारूप में, एक साथ luciferase संवाददाता plasmids के साथ, एक arrayed ओआरएफ अभिव्यक्ति पुस्तकालय से plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. जुगनू luciferase गतिविधि एक आंतरिक नियंत्रण निर्माण (Renilla luciferase निर्देशन एक एचसीएम्वी प्रमोटर) से अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत अल्फा synuclein प्रतिलेखन, पर प्रत्येक पुस्तकालय जीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए 48 घंटे के बाद assayed है. इस प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह प्रारूप में सड़न रोकनेवाला तरल से निपटने से करता है जो एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में संलग्न एक पीठ टॉप रोबोट, से मदद की है. हमारी स्वचालित अभिकर्मक प्रोटोकॉल उच्च throughput lentiviral पुस्तकालय उत्पादन या conju में अद्वितीय पुस्तकालय plasmids के बड़ी संख्या में ट्रिपल transfections की आवश्यकता के अन्य कार्यात्मक प्रदर्शन के प्रोटोकॉल के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैसहायक plasmids के एक आम सेट के साथ nction. हम यह भी एक सस्ता और मान्य विकल्प मौजूद PTC124, EDTA, और पूर्व Renilla luciferase की माप के लिए जुगनू luciferase गतिविधि को दबाने के लिए पायरोफास्फेट रोजगार जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, दोहरी luciferase अभिकर्मकों के लिए. इन विधियों का प्रयोग, हम 7670 मानव जीन की जांच की और अल्फा synuclein के 68 नियामकों की पहचान की. इस प्रोटोकॉल हित के अन्य जीन लक्ष्य को आसानी से परिवर्तनीय है.