Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

MiRNA stabili sono presenti in tutti i fluidi corporei e di alcuni microRNA circolanti sono protetti dalla degradazione di sequestro in piccole vescicole chiamate exosomes. Exosomes possono fondersi con la membrana plasmatica con conseguente trasferimento di RNA e proteine ​​per la cellula bersaglio. Le loro funzioni biologiche includono la risposta immunitaria, presentazione dell'antigene, e la comunicazione intracellulare. Consegna dei miRNA che possono regolare l'espressione genica nelle cellule riceventi attraverso il sangue ha aperto nuove strade per l'intervento di destinazione. Oltre ad offrire una strategia per la consegna di farmaci o RNA agenti terapeutici, contenuti exosomal possono servire come biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi, determinare le opzioni di trattamento e la prognosi.

Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi Western Blot per exosmarcatori Omal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l'etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l'integrità exosomal. L'RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l'mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell'RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse.

Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNAs exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura cellulare prima e dopo l'intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variations in miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane.

Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi western blot per i marcatori exosomal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l'etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l'integrità exosomal. L'RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l'mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell'RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse.

Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNA exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura delle cellule prima e dopo l'intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variazioni di miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane