Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

MiRNAs estáveis ​​estão presentes em todos os fluidos do corpo e em alguns miRNAs circulantes são protegidos da degradação por sequestração em pequenas vesículas chamadas exosomes. Exosomes podem fundir com a membrana plasmática que resulta na transferência de RNA e proteínas da célula-alvo. As suas funções biológicas incluem resposta imune, a apresentação de antigénio, e a comunicação intracelular. Entrega de miRNAs que podem regular a expressão do gene em células receptoras através do sangue, abriu novas possibilidades para intervenção alvo. Além de oferecer uma estratégia para a entrega de medicamentos ou agentes terapêuticos RNA, o conteúdo exosomal podem servir como biomarcadores que podem ajudar no diagnóstico, determinar as opções de tratamento e prognóstico.

Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para exosmarcadores Omal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.

Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal em pacientes, modelos de roedor e meios de cultura de células antes e após a intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostrar variations em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas.

Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para marcadores exosomal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.

Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal in pacientes, modelos de roedores e meios de cultura de células antes e depois da intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostram variações em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas